近期（2021–2024年）中国猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）临床分离株的流行病学及抗菌药物耐药性特征

《Animal Diseases》：Epidemiological and antimicrobial resistance characteristics of recent (2021–2024) Chinese Actinobacillus pleuropneumoniae clinical isolates

　　

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是猪接触性传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia）的病原，给全球养猪业造成重大经济损失。为明确当前中国APP的流行病学趋势及抗菌药物耐药谱，研究人员分析了2021年至2024年间从中国20个省份收集的90株临床分离株。血清分型（Serotyping）表明，血清15型（Serovar 15）已成为主要流行型（占分离株的36.7%），其流行率自2021年以来显著增加，并在2024年达到52.6%。相比之下，先前常见的血清1型和血清7型的流行率则波动或下降。这些分离株对盐酸多西环素（doxycycline hydrochloride）（77.8%）和氟苯尼考（florfenicol）（47.8%）表现出高耐药率。值得注意的是，多重耐药（Multidrug-resistant, MDR）分离株的比例从2021年的0%大幅增加到2024年的42.1%，且MDR表型在血清15型和血清7型中尤为普遍。相关性分析揭示某些抗生素（包括头孢菌素类）之间存在显著的交叉耐药风险。不同血清型间的生物学特性（包括生长速率和溶血活性）存在差异。本研究强调了中国APP流行血清型和耐药模式的显著转变，凸显了持续进行病原监测以指导疫苗开发和抗菌药物合理使用的必要性。

论文解读：中国2021–2024年猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）的流行病学与耐药性分析

研究背景与意义：

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是引起猪接触性传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia）的病原，该病以急性出血性、纤维素性和坏死性肺病变高为特征，伴随高死亡率，对全球养猪业造成显著经济损失。耐过急性感染的猪可能转为慢性感染或无症状带菌者，导致生长性能受损、饲料转化率降低，并增加抗菌药物使用及屠宰损失。目前，APP根据其烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD）生长依赖性分为生物I型（NAD依赖）和生物II型（NAD非依赖），并根据荚膜多糖基因差异分为19种血清型（Serovar），不同血清型的毒力因其携带的apx毒素基因组合而异。中国既往报道的优势血清型多为1、5、7型，但近年来血清型的分布动态及耐药模式随防控政策（如减抗替抗）和养殖模式变化而不断演变。由于APP的防控主要依赖疫苗接种和抗菌药物治疗，而耐药性问题日益严峻，且耐药基因可通过质粒、转poson等可移动遗传元件水平转移，不仅影响临床疗效，还对公共卫生构成潜在威胁。因此，持续开展全国性、大范围的APP流行病学及耐药性监测，对于掌握流行株的动态变化、指导疫苗选型（如多价灭活疫苗、亚单位疫苗）以及制定合理的临床用药方案至关重要。该研究发表于《Animal Diseases》期刊，旨在提供2021–2024年中国20个省份APP临床分离株的最新流行病学数据和耐药特征，为有效防控策略提供依据。

主要关键技术方法：

研究人员从武汉科前生物有限公司的研究实验室获取了2021年至2024年间从中国20个省份66个猪场提交的病料（急性呼吸道疾病死亡猪只的肺病变组织）中分离鉴定的90株APP临床分离株。细菌在含10 μg/mL NAD和5%新生牛血清的TSA培养基中，于37°C、5% CO₂条件下培养。血清分型采用两步多重PCR（Multiplex PCR）方法：第一轮靶向APP种特异性基因apxIVA及血清1–12和15型特异性基因；第二轮靶向nadV基因（用于区分生物II型）及血清13、14和16–19型特异性基因。抗菌药物敏感性测定采用 broth microdilution 法（根据CLSI指南），测试了10种代表9类的抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC），以APP ATCC 27090（血清3型）作为质控菌株，并依据CLSI断点判定敏感（S）、中介（I）、耐药（R），计算MIC₅₀和MIC₉₀。为比较不同血清型分离株的生物学特性，选取了不同地区的8株耐药分离株（血清1、7、15型）及可用的血清5、8、12型所有分离株，以各血清型标准参考菌株（如血清1型4074、血清5型L20、血清7型AP76、血清8型405、血清12型8329、血清15型HS143）为对照。生长曲线测定通过接种于含10 μg/mL NAD的TSB中摇床培养，每2小时测12小时OD_{600 nm}；溶血活性测定采用接种于含10 μg/mL NAD和5%脱纤绵羊血的TSA平板，37°C培养24小时后测量菌落周围溶血圈直径；生物膜形成能力采用结晶紫染色法定量，测OD_{595 nm}。统计学分析采用Fisher精确检验（Holm-Bonferroni校正）、Phi系数（φ）相关分析、单因素方差分析（ANOVA）等，使用GraphPad Prism 10和OriginPro 2024软件。

研究结果：

分布与流行率（Distribution and prevalence of Chinese A. pleuropneumoniae clinical isolates）：

90株APP分离株共鉴定出6种血清型。血清15型占比最高（36.7%，33/90），其次为血清1型（26.7%，24/90）、血清7型（24.4%，22/90）、血清5型（8.9%，8/90），血清8型（2.2%，2/90）和血清12型（1.1%，1/90）最少。年度动态分析显示，2021年血清1、7、15型为主要流行型；但从2023年至2024年，血清15型的流行率急剧上升，分别占当年分离株的57.1%和52.6%，而既往优势血清7型的流行率从2021年的41.7%降至2024年的5.3%。地理分布上，血清15型分布最广（13个省份，如湖北、湖南、广东），血清1型持续存在于9个省份（如甘肃、江西、陕西、云南），血清7型主要集中在中东部地区（如福建、江西、湖南、四川）。此外，49个农场（74.2%）仅分离到1株APP；16个农场（24.2%）同一时期分离到2–4株同血清型但耐药表型不同的菌株（暗示同血清型内的克隆多样性）；2个农场检测到混合血清型感染（2022年江西一农场同时分离到血清7和8型；2024年湖北一农场同时分离到血清1和7型）。

抗生素耐药表型（Antibiotic resistance patterns in isolates）：

在测试的8种抗菌药物（根据表格1数据）中，盐酸多西环素耐药率最高（77.8%），其次为氟苯尼考（47.8%），青霉素（22.2%）、头孢氨苄（cefalexin, 14.4%）、泰乐菌素（tylosin, 13.3%）、庆大霉素（gentamicin, 7.8%）耐药率中等，恩诺沙星（enrofloxacin, 5.6%）和头孢噻呋（ceftiofur, 3.3%）耐药率最低。MIC分析显示，盐酸多西环素的MIC₅₀和MIC₉₀均超过耐药折点；氟苯尼考的MIC₅₀处于中介范围，MIC₉₀超过耐药折点，表明整体敏感性显著下降；庆大霉素、恩诺沙星、头孢氨苄的MIC₉₀处于中介范围，MIC₅₀处于或低于敏感折点，意味着虽多数菌株仍敏感，但相当比例（>10%）已处于中介状态。

不同血清型间的耐药比较（Comparison of resistance among different serovars）：

在四种最主流血清型（1、5、7、15型）中，泰乐菌素、庆大霉素、恩诺沙星、头孢氨苄或头孢噻呋的耐药率无统计学显著差异。但盐酸多西环素耐药率在血清15型显著高于血清5型和7型（P < 0.05）；氟苯尼考耐药率在血清1型显著高于血清5型和15型（P < 0.05）；青霉素耐药率在血清15型显著高于血清1型（P < 0.01）。

多重耐药（MDR）与时间及血清型的关系（Relationship of multidrug resistance (MDR) with time and serovar）：

研究期间，对三类及以上抗菌药物类别的MDR比例增加。2021年未检测到MDR菌株，而2024年这一比例升至42.1%；同时对任何类别抗菌药物均无耐药的菌株比例从2021年的25%稳步降至2024年的5.3%。在18株确定的MDR菌株中，血清15型（10/18, 55.6%）和血清7型（5/18, 27.8%）为主，血清1、5、8型各仅1株。对四种主要血清型的分析未发现MDR总体分布的显著差异（可能受样本量限制）。抗生素类别间的耐药相关性统计显示，所有抗生素对的Phi系数均为正值，表明耐药性状间呈正相关；其中庆大霉素与泰乐菌素相关性最强（φ = 0.456, p < 0.001），头孢氨苄与庆大霉素、头孢噻呋与头孢氨苄等组合也显著相关（p < 0.05），提示这些抗生素间存在潜在的交叉耐药模式。

不同血清型的生物学特性比较（Comparison of biological characteristics among different serovars）：

不同血清型分离株的生长模式、溶血活性和生物膜形成能力存在差异。所有代表血清型分离株接种约4小时后进入对数中期。对数期，血清1型和5型分离株的生长速率慢于各自参考株；血清5型和7型分离株在稳定期的生长速率低于参考株；总体而言，血清1、8、15型分离株的生长速率大于血清5、7、12型分离株。溶血圈直径方面，血清7、8、12、15型产生的溶血圈显著小于血清1型和5型（P < 0.001），分离株与参考株间无显著差异。生物膜形成方面，静态培养条件下的定量评估显示，所有血清型分离株形成的生物膜水平与其各自参考株相似，不同血清型间未检测到显著差异。

讨论与结论总结：

该研究分析了中国20个省份2021–2024年90株APP临床分离株的血清型分布、抗菌药物耐药及生物学特性。结果揭示最流行的血清型为15型（36.7%）、1型（26.7%）和7型（24.4%），与近期中国另一项12省份研究一致，表明这些血清型目前在中国占主导。APP血清型分布存在亚洲区域内差异（如韩国以1、5型为主，日本以2型为主），欧洲各国亦不同（德国、波兰以2型为主，意大利以9/11型为主，英国、挪威以8型为主）。研究揭示了血清型组成的显著时间变化：2023–2024年血清15型分离率急剧上升，分布扩展至13省，而既往优势血清7型检出率下降；血清15型在中国13/20省份的检测及其在北美的相关报道，提示该血清型可能正经历更广泛的区域传播甚至潜在全球谱系扩张，因此持续监测血清型动态对指导疫苗选择和防控策略至关重要。

耐药方面，四环素类（广泛应用抗菌药）的高耐药率在国际（意、韩、中、日）均有报道，本研究盐酸多西环素耐药率77.8%与国际趋势一致；但波兰研究显示同类药物中多西环素与四环素、土霉素耐药率有差异，提示监测评估时需注意个别药物而非整个类别笼统概括。氟苯尼考在多个国报道低耐药，但韩国（45%）和本研究（47.8%）较高；近期意大利2024年研究也报增加趋势，推测与当地频繁用药有关；既往报道氟苯尼考耐药常与携带floR基因的质粒等可移动遗传元件传播相关，本研究的高耐药是否同源需进一步基因组测序分析。β-内酰胺类中，青霉素和头孢氨苄中等耐药，头孢噻呋低耐药；统计显示头孢氨苄与头孢噻呋耐药显著相关，但二者与青霉素均不显著相关，提示虽同属β-内酰胺类且作用机制相似，但介导耐药的具体分子机制或遗传背景可能不同。庆大霉素耐药率（7.8%）低于波兰、德国、罗马尼亚、韩国报道的20–45%，恩诺沙星低耐药与波兰、德国一致。MDR菌株的出现与增加是临床关切现象：2021年无MDR，2024年达42.1%，全敏感株比例锐减；这反映近年中国的耐药时间变化趋势，可能与抗菌药选择压力显著增加（用药强度、不当用药方案或耐药基因传播）有关。MDR菌株中血清15型占55.6%，但统计未显示不同血清型与MDR流行率有显著关联（可能受总样本量限制）；意大利研究显示MDR分离率与血清型有关（9/11型占最大比例）。此外，某些药物与血清型的耐药表型相关：如血清1型对氟苯尼考耐药显著高于5和15型，血清15型对青霉素耐药显著高于1型，表明耐药表型可能因血清型而异，其与特定耐药基因、可移动遗传元件或优势克隆传播的关系值得进一步研究（尤其近年检出率增加的血清15型）。

生物学相关表型也具有血清型特异性：所有血清型菌株体外约4小时进入对数生长期；1、5、7型分离株生长速率低于参考株，1、8、15型相对较快。溶血活性（直接反映菌株毒力，与ApxI等毒素有关）在不产生强溶血毒素ApxI的血清7、8、12、15型中显著小于产生ApxI的血清1和5型。生物膜形成对APP在宿主体内呼吸道持续定植及增加抗菌药压力和免疫清除抗性至关重要，本研究数种血清型分离株体外可形成生物膜，与既往报道一致。研究中血清15型菌株体外生长相对迅速，暗示其可能具备一定传播或竞争优势；虽溶血活性弱，但代表株生物膜形成能力强，且未发表感染实验数据显示其引起临床体征相对轻微，但可在扁桃体及肺内持续存留超35天，并能持续在饲槽、饮水、地板、通风设备等环境样本检出，表明其强持续感染和环境排菌能力，这可能解释为何血清15型逐渐成为优势型。此外，既往中国许多猪场未广泛实施APP疫苗接种，血清15型增加在此期间已发生，暗示其涌现可能并非主要由疫苗选择压力驱动；目前部分农场使用多价灭活和亚单位疫苗，虽可能降低死亡率，但临床观察常无法完全消除细菌定植，鉴于血清15型在扁桃体强持久性，现行疫苗对其带菌状态控制效果可能有限。综上，血清15型隔离率增加可能非单因素驱动，而是相对生长快、持续定植与环境排菌能力强、当前疫苗控制定植和带菌能力有限等因素共同作用的结果。

结论（Conclusion）：

研究人员对2021–2024年中国20个省份90株APP临床分离株的血清型分布及抗菌药物耐药动态变化进行了系统分析。结果表明APP血清型流行率已改变，血清15型成为最流行型；不同血清型间耐药谱存在显著差异；此外，MDR分离株比例呈逐年增加趋势；生长速率、溶血活性、生物膜形成等生物学特性因血清型而异。这些结果为中国APP防控策略制定提供了新颖的流行病学数据。