芪苓扶正清解颗粒通过线粒体能量代谢减轻阿霉素诱导的T细胞免疫功能障碍的机制研究

《Chinese Medicine》：Mechanism of Qiling Fuzheng Qingjie granules in alleviating doxorubicin-induced T cell immune dysfunction via mitochondrial energy metabolism

　　

本研究探讨了芪苓扶正清解颗粒（QFQ）调节阿霉素（DOX）化疗后免疫功能的机制。研究人员采用网络药理学分析探索了QFQ与免疫系统之间的关系。建立了DOX诱导的免疫功能障碍小鼠模型，并使用QFQ进行治疗。研究人员系统地评估了QFQ对免疫器官、骨髓造血功能、T细胞亚群分布与功能、线粒体代谢及抗肿瘤疗效的影响，所用技术包括组织学染色、外周血常规分析、流式细胞术（Flow Cytometry, FC）和Seahorse代谢分析。结果表明，QFQ显著减轻了DOX诱导的胸腺和脾脏萎缩，保留了骨髓造血功能，并减少了外周血细胞丢失。在机制上，QFQ改善了线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, ΔΨm）和氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OXPHOS），从而恢复了T细胞代谢能力，增强了T细胞活化与增殖，并恢复了细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL）功能。因此，QFQ重新平衡了Th1/Th2/Th17/调节性T细胞（Treg）、效应记忆T细胞（Effector Memory T cells, Tem）/效应T细胞（Effector T cells, Teff）和中央记忆T细胞（Central Memory T cells, Tcm）亚群之间的动态，改善了DOX诱导的免疫失调。此外，QFQ干预不仅增强了A20淋巴瘤小鼠模型中的抗肿瘤疗效，还显著减轻了CD8+T细胞中的耗竭表型。总之，该研究确立QFQ主要通过调节线粒体能量代谢来增强T细胞功能表现。通过恢复T淋巴细胞中的代谢稳态，QFQ有效抵消了DOX诱导的免疫功能障碍，突出了其作为化疗诱导免疫抑制中有前景的辅助疗法的潜力。

论文解读：芪苓扶正清解颗粒通过线粒体能量代谢缓解阿霉素诱导的T细胞免疫功能障碍

研究背景与目的

化疗是肿瘤治疗的常用手段，但常伴有骨髓抑制和免疫抑制等不良反应，常导致治疗中断、剂量降低以及感染和肿瘤复发风险增加。阿霉素（Doxorubicin, DOX）作为治疗淋巴瘤和乳腺癌等恶性肿瘤的主要化疗药物，虽然在治疗初期可引发免疫反应，但随着连续治疗周期，会逐渐表现出显著的免疫抑制效应，这与其对T细胞衰老或功能障碍的影响密切相关。T细胞代谢重编程是化疗诱导T细胞损伤的关键驱动因素，化疗可损害T细胞线粒体，导致线粒体膜电位降低和不同线粒体储备耗竭，最终危及T细胞的能量供应和代谢能力，导致T细胞数量和功能下降。芪苓扶正清解颗粒（Qiling Fuzheng Qingjie Granule, QFQ）是福建中医药大学附属第二人民医院的院内制剂，属于扶正祛邪类中药复方，由黄芪、灵芝、夏枯草、山药、白花蛇舌草和女贞子组成，主要用于癌症患者围手术期、化疗和放疗期间。既往基础研究表明QFQ可通过线粒体依赖性途径诱导肿瘤细胞凋亡，并通过调节糖酵解相关蛋白和改善能量代谢抑制肿瘤生长，还可抵消环磷酰胺（CTX）诱导的体重减轻、胸腺萎缩、白细胞减少等免疫功能障碍。然而，QFQ从线粒体能量代谢角度对化疗诱导免疫失调的影响仍不明确。因此，本研究旨在通过网络药理学和体内外实验，阐明QFQ通过调节线粒体能量代谢减轻DOX诱导的T细胞免疫功能障碍的机制，该研究发表在《Chinese Medicine》期刊。

主要关键技术方法

研究人员首先通过网络药理学分析，利用TCMSP数据库筛选QFQ活性成分，SwissTargetPrediction预测潜在靶点，GeneCards获取免疫相关靶点，STRING构建蛋白互作（PPI）网络，Metascape进行GO和KEGG富集分析。动物实验方面，建立DOX诱导的免疫功能障碍SPF级BALB/c雄性小鼠模型（n=12/组），设对照组、DOX组、QFQ组和DOX+QFQ组，评估体重、胸腺和脾脏指数、血常规、骨髓涂片、H&E染色等；并建立A20淋巴瘤细胞皮下接种的术后化疗肿瘤复发模型（n=3/组），评估肿瘤生长及CD8⁺T细胞耗竭。体外实验方面，进行T细胞活化克隆观察、流式细胞术检测T细胞亚群（Th1/Th2/Th17/Treg、Tn/Tem/Teff/Tcm）、活化（CD25、CD27）、增殖（CFSE）、CTL功能（穿孔素、IFN-γ），线粒体检测采用Mito-Tracker Deep Red 633染色和JC-1法，代谢分析采用Seahorse XF技术进行线粒体压力测试、实时ATP速率测定和糖酵解速率测定。

研究结果

1. 1.
   QFQ的活性成分及其潜在免疫相关靶点的GO和KEGG通路富集分析
   研究人员通过网络药理学分析鉴定出QFQ的57个活性成分和746个预测靶点，与免疫应答相关的2061个靶点取交集得到507个共同靶点。PPI网络分析显示核心靶点包括JUN、LCK、CDK1、TNF、FOS、IL-6、IL-2、MTOR、IL-1β等。GO分析表明生物过程主要涉及白细胞和淋巴细胞活化及分化、ATP代谢调节、T细胞活化及分化、线粒体膜电位调节等；KEGG分析显示涉及PI3K-Akt信号通路、T细胞受体通路、Toll样受体通路、mTOR信号通路、AMPK信号通路等，提示QFQ可能通过多靶点免疫调节作用影响T淋巴细胞功能，且与线粒体功能密切相关。
2. 2.
   QFQ改善DOX化疗后小鼠的状态
   研究人员建立DOX诱导的免疫失调小鼠模型并给予QFQ干预，结果显示QFQ本身未引起体重减轻，虽未显著阻止DOX导致的体重下降，但具有免疫器官保护效应。DOX+QFQ组胸腺重量、脾脏重量及胸腺指数显著高于DOX组；H&E染色显示DOX导致胸腺结构破坏、皮质淋巴细胞减少、皮髓质边界模糊，而QFQ减轻了DOX诱导的胸腺损伤，胸腺小叶结构清晰，淋巴细胞密集。
3. 3.
   QFQ保护DOX诱导的骨髓造血损伤
   研究人员通过骨髓涂片、网织红细胞计数和血常规评估造血功能，发现DOX组晚幼红细胞和淋巴细胞比例显著降低，分叶中性粒细胞比例相对增加；DOX+QFQ组早幼/中幼红细胞和淋巴细胞比例升高，分叶中性粒细胞减少。DOX显著抑制网织红细胞生成，DOX+QFQ组网织红细胞比例显著升高。血常规显示DOX组白细胞（WBC）、淋巴细胞计数显著降低，中性粒细胞和单核细胞比例升高；DOX+QFQ组WBC计数和淋巴细胞计数显著恢复，单核细胞计数和比例下降，表明QFQ保护骨髓造血功能，尤其促进淋巴细胞恢复。
4. 4.
   QFQ恢复DOX降低的脾脏T和B细胞比例
   研究人员通过流式细胞术分析脾脏白细胞亚群，发现DOX组粒细胞、单核细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞比例显著降低，巨噬细胞比例升高；DOX+QFQ组B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞比例显著升高，巨噬细胞比例降低。t-SNE分析显示DOX组脾脏白细胞总数显著下降，主要因T和B细胞减少，QFQ处理后两者均显著恢复，表明QFQ选择性恢复T和B细胞频率，重建适应免疫的有利条件。
5. 5.
   QFQ促进Th1/Th2分化，抑制Treg抑制受体表达，保护Tcm和Tem/Teff免受DOX损伤
   研究人员分析脾脏T细胞亚群，发现DOX显著降低CD4⁺T细胞中Th1和Th2细胞比例，Th1/Th2比值不变；DOX+QFQ组Th1和Th2比例显著升高。DOX显著增加Treg细胞及其KLRG-1⁺亚群比例，Th17/Treg比值降低；DOX+QFQ组KLRG-1⁺Treg比例显著降低。DOX使CD4⁺和CD8⁺T细胞中Tem/Teff和Tcm比例降低，初始T细胞（Tn）比例增加；DOX+QFQ组Tem/Teff和Tcm比例显著升高，Tn比例降低，表明QFQ特异性保护Tcm和Tem/Teff免受DOX损伤，恢复T细胞异质性。
6. 6.
   QFQ减轻DOX诱导的T细胞活化抑制（体外）
   研究人员通过体外T细胞培养系统观察，DOX组淋巴细胞形态均匀球形，克隆球直径显著减小，细胞存活率降低，CD4⁺CD25⁺、CD8⁺CD25⁺、CD4⁺CD27⁺、CD8⁺CD27⁺T细胞比例降低；DOX+QFQ组淋巴细胞形态多样、克隆球直径增大，细胞存活率升高，上述活化标志物比例升高，表明QFQ改善DOX诱导的T细胞存活和活化抑制。
7. 7.
   QFQ恢复DOX化疗后的T细胞增殖并增强CTL细胞毒功能
   研究人员通过CFSE增殖实验，发现DOX组CD4⁺和CD8⁺T细胞增殖显著抑制，分裂细胞仅占约20%；DOX+QFQ组分裂指数和增殖细胞比例显著升高。CTL功能检测显示，DOX组IFN-γ⁺和穿孔素⁺CD8⁺T细胞比例降低；DOX+QFQ组显著恢复，表明QFQ抵消DOX对T细胞增殖的抑制，恢复CTL细胞毒功能。
8. 8.
   QFQ改善DOX诱导的T细胞线粒体膜电位紊乱
   研究人员通过Mito-Tracker Deep Red 633染色，发现DOX组红色荧光阳性T淋巴细胞仅占2–5%，DOX+QFQ组升至20–40%。JC-1流式分析显示DOX组红色荧光降低、绿色荧光升高，红/绿比值降低；DOX+QFQ组红色荧光升高、绿色荧光降低，红/绿比值显著升高，表明QFQ有效减轻DOX诱导的线粒体膜电位破坏，改善T淋巴细胞功能状态。
9. 9.
   QFQ改善DOX诱导的线粒体氧化呼吸和糖酵解功能损伤
   研究人员通过Seahorse线粒体压力测试，发现DOX组T细胞ATP产生、基础呼吸、非线粒体耗氧、质子漏、ECAR和OCR降低；DOX+QFQ组上述参数显著恢复。实时ATP速率测定显示DOX组ECAR、PER、OCR、糖酵解ATP、OXPHOS ATP和总ATP降低；DOX+QFQ组均显著恢复。糖酵解功能测定显示DOX组ECAR、糖酵解PER、基础糖酵解能力、基础质子外流速率等降低；DOX+QFQ组显著改善，表明QFQ改善线粒体氧化磷酸化和糖酵解，恢复T细胞代谢能力。
10. 10.
    QFQ增强术后化疗复发模型中的抗肿瘤效应并逆转T细胞耗竭
    研究人员在A20肿瘤复发模型中，发现DOX+QFQ组肿瘤大小、重量和体积显著小于DOX组。流式分析显示DOX+QFQ组CD8⁺T细胞比例升高，CD8⁺CTLA-4⁺T细胞比例降低，表明QFQ提高效应T细胞抗肿瘤活性，增加CD8⁺T细胞肿瘤浸润，下调CTLA-4表达，减轻T细胞耗竭，改善肿瘤免疫微环境。

讨论与结论总结

讨论部分指出，QFQ各单味药（灵芝、黄芪、山药、女贞子、夏枯草、白花蛇舌草）均具有免疫调节作用，网络药理学提示QFQ可能通过T细胞受体信号通路调节抗肿瘤免疫，关键单体成分（灵芝酸Mf、木犀草素、槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、芒柄花素）在免疫调节中起重要作用。DOX导致胸腺和脾脏萎缩、骨髓造血抑制（尤其红系和淋巴系）、脾脏白细胞亚群改变（T/B细胞减少、巨噬细胞增加）；QFQ减轻这些损伤，恢复淋巴细胞和网织红细胞比例，降低单核细胞计数，可能抑制化疗诱导的肿瘤转移。DOX抑制Th1/Th2分化，增加KLRG-1⁺Treg比例，破坏Th17/Treg平衡；QFQ恢复Th1/Th2分化，下调Treg上KLRG-1，重建免疫平衡。DOX使增殖性T细胞亚群（Tem/Teff、Tcm）减少、静息Tn相对增加；QFQ恢复T细胞多样性。QFQ单独使用时虽降低T细胞活化增殖，但增强CTL细胞毒功能，呈“低增殖、高细胞毒”表型，可能与黄酮类和植物甾醇等抗氧化成分减少过度ROS、保留CTL效应功能有关。化疗通过损伤线粒体OXPHOS、抑制代谢重编程导致T细胞功能障碍；QFQ恢复线粒体膜电位和OXPHOS，促进代谢重编程，助力T细胞活化、增殖和分化。在肿瘤复发模型中，QFQ增强抗肿瘤免疫，减轻CD8⁺T细胞耗竭，重塑肿瘤免疫微环境。

结论：QFQ可能通过调节线粒体氧化磷酸化和糖酵解，增强线粒体膜电位，恢复T细胞代谢能力。这种代谢修复恢复了CTL细胞毒功能，增强T细胞活化并促进增殖。因此，QFQ通过重新平衡白细胞亚群、改善DOX化疗后的骨髓造血功能和小鼠整体生理状态，减轻化疗诱导的免疫失调，作为化疗诱导免疫抑制的辅助疗法具有潜力。