《Journal of Applied Genetics》：The transcription factor LEC2 as an epigenetic regulator of plant totipotency: from Arabidopsis to crop improvement
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植物细胞全能性——即分化的体细胞再生完整植株的能力——是植物发育最显著的特征之一，也是生物技术领域的基石。体细胞胚胎发生（Somatic Embryogenesis, SE）是这一潜能最突出的体现，为无性繁殖、遗传转化和功能基因组学提供了强有力的体系。在分子层
植物细胞全能性——即分化的体细胞再生完整植株的能力——是植物发育最显著的特征之一，也是生物技术领域的基石。体细胞胚胎发生（Somatic Embryogenesis, SE）是这一潜能最突出的体现，为无性繁殖、遗传转化和功能基因组学提供了强有力的体系。在分子层面，SE由转录因子（Transcription Factors, TFs）调控，这些因子将激素信号、代谢信号与染色质重塑相整合，从而在体细胞中激活胚胎发生程序。在SE相关转录因子中，拟南芥（Arabidopsis thaliana）的LEAFY COTYLEDON2（LEC2）已成为胚胎发生转换的关键调控因子。LEC2既作为生长素响应的发育开关，又作为表观遗传调节因子，招募染色质调节因子重编程转录网络，进而控制植物细胞全能性。本综述（i）概述拟南芥作为研究SE与全能性模型的价值，（ii）强调LEC2兼具表观遗传调控靶点与架构者的双重角色，（iii）探讨基于转录因子的策略在植物再生与作物改良中的转化前景。研究人员总结了证明LEC2协调转录调控与表观遗传重塑、作为植物全能性中枢的证据，并以图示方式呈现。围绕LEC2的SE研究不仅深化了对植物全能性分子基础的理解，也为跨物种提升再生效率提供了概念框架。
引言
植物细胞全能性是发育可塑性的典型表现，其应用潜力自无菌离体培养技术诞生之初便被认识到，奠定了现代植物生物技术的基础。SE是最直观体现全能性的过程：体细胞经重编程进入胚胎发生途径，产生体细胞胚并最终发育为完整植株。自20世纪中期在胡萝卜培养中发现以来，SE已被广泛应用于优良品种无性繁殖及转基因与基因组编辑育种。理解控制全能性与SE的内源因子，以及通过内源通路发挥作用的外源因子，对开发生物技术方法至关重要。尽管再生技术已取得长足进步，但全能性与胚胎发生潜能的强基因型依赖性仍是主要瓶颈，尤其在单子叶作物（如水稻、小麦、玉米、大麦）中，仅有少数栽培种能在离体条件下稳定再生。因此，克服难再生基因型的低再生能力是推动分子育种、培育气候适应性作物的关键一步。解析外源生长素如何启动胚胎发生转换，以及下游转录因子（如LEC2）如何进一步促进生长素生物合成，对理解植物再生潜能至关重要。模式植物拟南芥在器官发生与体细胞胚胎发生等再生途径研究中的应用，极大推动了研究人员对植物全能性遗传与表观遗传机制的认知，其独特性也使相关研究的意义超越植物界，延伸至动物与医学领域。
拟南芥作为体细胞胚胎发生研究的模型
在拟南芥中，SE通常以胚胎或分生组织来源的组织为外植体，其中未成熟合子胚（Immature Zygotic Embryos, IZEs）最为常用。IZEs的发育阶段决定了SE是直接发生还是间接发生（经由愈伤组织）。处于鱼雷期的年轻IZEs产生胚性愈伤组织，再分化出体细胞胚；而弯月期晚期的IZEs在高浓度合成生长素（5 μM 2,4-D）的B5培养基上可直接产生体细胞胚，65%–90%的外植体可在两周内诱导成功。2,4-D虽为合成生长素类似物，但在SE研究中传统称为“生长素培养基”，其通过刺激内源生长素（吲哚-3-乙酸，IAA）的生成与分布，以生长素类似物与胁迫因子的双重角色间接调控发育重编程。组织学研究表明，胚性细胞起源于子叶近轴面的原表皮层及亚原表皮层，体细胞胚可为单细胞或多细胞起源。直接体细胞胚胎发生（Direct Somatic Embryogenesis, DSE）来源的胚既可转移至无激素培养基成苗，也可转入更高浓度2,4-D（9 μM）的液体培养基诱导胚性愈伤，进而通过间接SE（Indirect Somatic Embryogenesis, ISE）产生体细胞胚。基于弯月期IZEs的DSE体系是目前研究体细胞胚胎发生起始与早期转换分子机制的最高效、应用最广的系统。其他外植体（如球形期或早鱼雷期IZEs、幼苗茎尖分生组织区、萌发种子或根来源原生质体）诱导SE的频率极低且不稳定。
转录因子LEC2对体细胞胚胎发生的转录调控
与动物类似，转录因子在体细胞重编程为多能/全能状态中起核心作用，并主导SE与植物再生。拟南芥中数百个转录因子基因在细胞重编程过程中差异表达，但已明确的是，特定转录因子集合通过整合激素信号、代谢程序、转录级联与染色质重塑来控制全能性。已鉴定的SE相关转录因子（SE-TFs）主要包括LEAFY COTYLEDON1（LEC1）、LEC2、FUSCA3（FUS3）、MYB118、SHOOT MERISTEMLESS1（STM1）、AGAMOUS-LIKE15/18（AGL15/18）、GROWTH REGULATING FACTOR（GRF）、PLETHORA4/BABY BOOM（PLT4/BBM）、PLT5/EMBRYO MAKER（PLT5/EMK）、RWP-RK DOMAIN?CONTAINING PROTEIN（RKD）、AT-HOOK MOTIF NUCLEAR LOCALIZED 15（AHL15）、WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATION1（WIND1）、WUSCHEL（WUS）及WUSCHEL-related homeobox（WOX）蛋白等。LEC1与LEC2同ABA INSENSITIVE3（ABI3）、FUS3共同组成LAFL基因家族，最初被鉴定为合子胚发生与种子发育的主调控因子。异位表达LEC1或LEC2可自发诱导体细胞胚胎发育，因此被视为SE调控网络的核心组分。结构上，LEC1属于NF-YB（Nuclear Factor Y, subunit B）转录因子家族，通过组蛋白折叠域与NF-YA、NF-YC形成异源三聚体复合物，结合靶基因启动子的CCAAT元件调控植物生长发育与胁迫响应。LEC2则属于植物特有的转录调节因子大家族，通过保守的B3结构域识别调控植物胚胎发生、种子发育与胁迫响应的基因启动子中的RY顺式元件。值得注意的是，B3家族成员可相互调控表达，且LEC2启动子中也存在B3结合的RY元件。此外，LEC2启动子中还鉴定出RLE、GAGA/GA重复序列、CArG盒及生长素响应元件（AuxRE）等多种调控元件，表明该基因受复杂调控。与外源生长素处理一致，LEC2转录水平在SE诱导的外植体中显著变化，且LEC2表达与SE诱导外植体中生长素积累区域共定位。目前尚未完全明确结合LEC2启动子的ARF种类，但ARF5是候选之一。在种子发育与SE中，LEC1与LEC2相互影响表达，但尚无直接转录调控证据。LEC1与LEC2还可与AP2/ERF家族转录因子BBM互作，后者同样能诱导SE并促进营养组织细胞分裂。除LEC–BBM模块外，WUS/WOX转录因子构成SE调控网络的另一核心轴。WUS及同源WOX蛋白是植物特有的同源框转录因子，调控干细胞命运、发育重编程与全能性。WUS维持茎顶端分生组织干细胞特性，并可异位触发SE；WOX5在根顶端分生组织中发挥类似功能，近期研究显示其通过生长素依赖途径重编程体细胞走向胚胎发生。重要的是，WOX2与WOX3这两个早期胚胎模式建成基因被鉴定为拟南芥SE中LEC2的直接靶基因，从而将LEC2驱动的途径与WUS/WOX网络联系起来，表明LEC2不仅与BBM整合信号，还与WOX介导的调节因子协同建立体细胞重编程所需的转录框架。
LEC2在生长素介导的SE中的关键作用
生长素在SE诱导中的核心地位决定了其代谢与响应的协同调控对体细胞胚胎发生重编程至关重要。虽然IAA是主要内源生长素，但其他天然生长素与合成生长素类似物对生长素信号输出的调控存在差异，最终均汇聚于LEC2为中心的转录网络，控制胚胎发生重编程。在SE相关转录因子中，多数（包括LEC2）与生长素生物合成、信号转导及运输存在多重关联。LEC2主要通过激活YUCCA（YUC）基因促进SE，YUC编码色氨酸依赖IPA-YUC途径中的关键单加氧酶，在SE诱导中起核心作用。在植株中，LEC2直接激活YUC1与YUC4；而在体细胞胚胎发生过程中，YUC1、YUC4及胚胎特异性YUC10的上调伴随LEC2依赖的胚胎发生重编程。通过促进生长素生物合成，LEC2有助于维持胚胎细胞特性，并促进多细胞原胚及其后续胚胎发育，这些过程均依赖内源生长素生成。除生长素生物合成外，生长素信号通路核心组分（AUX/IAA、AUXIN RESPONSE FACTOR [ARF]基因）及生长素外排载体PIN-FORMED（PIN1、PIN7）也在SE诱导中发挥重要作用。SE诱导伴随ARF与AUX/IAA转录水平的广泛变化，以及PIN生长素外排载体的表达与极性定位的动态改变。最新证据表明，WOX5在体细胞胚胎发生过程中调控生长素信号与运输的关键组分（包括ARF5与PIN1），但其直接调控机制及与LEC2等其他SE相关转录因子的互作仍有待阐明。除LEC2外，BBM与WUS/WOX等其他主效SE转录因子也通过促进YUC/TAA依赖的生长素生物合成，协助建立胚胎发生承诺所需的富生长素细胞环境。在水稻中，OsBBM1直接激活合子表达的YUC基因，这对体细胞胚起始至关重要，体现了SE转录因子自主增强内源生长素生成的机制。在拟南芥中，BBM与WOX5转录激活YUC/TAA途径组分，进一步强化支撑LEC2依赖胚胎发生重编程的生长素生物合成程序。LEC2与其他SE相关转录因子之间的广泛互作调控SE过程中的生长素生物合成，其中LEC2–BBM互作是该调控网络的核心。BBM位于上游，直接调控LEC1与LEC2，而LEC2则定量调控BBM。BBM–LEC1/LEC2–YUC级联反应通过IPA–YUC途径增强生长素生物合成，局部生长素积累进而触发数百个在胚胎发生诱导阶段差异表达的生长素响应基因。外源生长素主要支持诱导阶段，而通过IPA–TAA1/YUCCA途径的内源IAA生物合成及协同的极性生长素运输，则支撑随后的生长素流形成与胚胎发育过程中的模式建成，这体现了SE中多途径、阶段依赖的内源生长素生物合成特征。在SE中，生长素与细胞分裂素、赤霉素（Gibberellins, GA）、脱落酸（Abscisic Acid, ABA）等其他激素广泛互作，形成多层调控网络，调控细胞命运获得、胚性能力与SE诱导。与此一致，LEC2过表达除影响生长素外，还显著改变其他内源激素（包括细胞分裂素、水杨酸与脱落酸）的积累。在种子发育中，LEC2与其他LAFL基因共同主要调控ABA/GA平衡。ABA与GA在不同植物中均影响SE诱导，拟南芥aba与ga突变体表现出SE响应缺陷。研究显示，LEC2通过直接调控赤霉素相关的MADS-box转录因子基因AGAMOUS-LIKE15（AGL15）参与SE中的GA信号转导，AGL15通过降低活性GA水平调节GA稳态，创造有利于SE的激素环境。此外，LEC2与乙烯也存在调控互作，LEC2影响SE中调控乙烯代谢与信号的转录因子ERF022的表达。除激素外，细胞代谢组的其他组分也显著影响胚性细胞能力。在拟南芥中，贮藏蛋白与脂质的积累与较晚发育阶段IZE外植体较高的胚性潜能相关。LEC2被认为参与了贮藏物质的积累，最新研究显示，LEC2直接激活脂质代谢关键调控因子WRINKLED1（WRI1），后者控制SE中油体蛋白（OLEOSIN3, OLE3）的产生；缺失WRI1会损害LEC2诱导的SE，这为LEC2如何触发成熟样性状、营造胚性细胞环境提供了机制解释。
发育转换过程中LEC2的表观遗传调控
LEC1、LEC2、BBM、WUS、AGL15等关键形态发生调控因子在植物发育过程中呈现严格的组织特异性和时空表达模式，从而将胚性能力限制在特定的细胞、组织类型与发育阶段。表观遗传修饰（包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化、核小体重塑及组蛋白变体置换）通过改变染色质可及性调控基因表达，实现植物发育中的细胞重编程。全能性调控因子的时空表观遗传控制深刻影响了胚性外植体的稀缺性。在许多植物（包括谷物与拟南芥）中，仅IZEs含有SE潜能细胞，而幼苗与植株外植体大多难以诱导胚胎发生重编程，这可能与分化器官中生长素生物合成的受限及非许可的表观遗传景观有关。拟南芥中胚胎期局限的SE能力部分源于种子萌发后胚胎相关基因的表观遗传沉默。图示展示了拟南芥SE能力的发育窗口：伴随合子到营养生长的转换，LEC2表达的表观遗传沉默导致萌发后组织丧失胚性能力。抑制胚胎基因（包括LEC2）表达的关键机制涉及Polycomb抑制复合物1与2（Polycomb Repressive Complexes 1 and 2, PRC1 and PRC2）。在该机制中，LEC2启动子中的多个RY基序被VAL1/VAL2蛋白识别，介导PRC2招募至靶基因染色质，并沉积抑制性表观遗传标记H3K27me3。PRC2建立的组蛋白抑制标记H3K27me3结合PRC1亚基（如拟南芥中的LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 [LHP1/TFL2]），后者通过RING指蛋白（AtBMI1A/B, AtRING1A/B）催化组蛋白H2A的单泛素化（H2Aub）。根据经典的Polycomb抑制层级模型，H3K27me3沉积是PRC1招募的识别标记，即PRC2作用于PRC1上游；但最新对分化胚胎干细胞的全基因组分析提示，在特定位点PRC1可能先于PRC2稳定沉积H3K27me3，其招募顺序具有位点与背景依赖性。LEC基因在种子发育与SE中的调控似乎遵循经典模型，即PRC2通过沉积H3K27me3启动基因抑制，PRC1通过H2Aub与LHP1结合强化并稳定该状态。PRC2与PRC1复合物在VAL1/VAL引导下，协同组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylases, HDACs）等其他表观遗传抑制因子，阻止LEC1与LEC2在营养组织中的转录重新激活，将胚性潜能限制在合子胚中。在沉默LEC2等发育调控因子的过程中，Polycomb抑制复合物还与染色质重塑因子协同作用，包括ATP依赖的PICKLE（CHD3/MI-2）与SWI/SNF（SWITCH deficient SUCROSE NONFERMENTING）复合物。CHD3重塑因子PICKLE（PKL）促进PRC2/PRC1活性及H3K27me3标记的扩散，与分化营养细胞类型的核小体凝聚相关；pkl突变体中LEC基因的去抑制恢复了幼苗的胚胎特性。与Polycomb及PKL介导的、维持营养特性并限制SE能力的染色质抑制相反，包含BRAHMA（BRM）与SPLAYED（SYD）ATP酶的SWI/SNF重塑复合物与H3K27去甲基化酶（如REF6）密切协作，开放染色质并激活LEC2等胚胎发生调控因子。BRM/SYD由ARF5/MP招募，在生长素调控的花原基起始的细胞命运转换中增加生长素响应靶点的染色质可及性；鉴于花器官发生与胚胎发生转换的转录组变化具有相似性，推测BRM/SYD也可能参与胚性位点的去抑制。另一尚未探索的SE基因去抑制表观遗传机制涉及组蛋白变体（如H3.15与H2A.Z）对经典组蛋白的置换，这类变体与植物发育及胁迫响应相关。H3.15变体缺乏H3K27me3所需的K27残基，因而拮抗Polycomb抑制并提高重编程能力，促进多能愈伤细胞产生；组蛋白变体是否通过松动与LEC2等胚胎发生调控因子的染色质结合参与调控，是未来值得研究的方向。基因调控的表观遗传图谱还包括非编码RNA（non-coding RNAs, ncRNAs），特别是microRNAs（miRNAs），它们通过靶向mRNA降解或翻译抑制，或通过互作染色质修饰因子调控植物发育、胁迫响应及SE。miRNA介导的SE调控涉及miR165/166与miR160：miR165/166抑制LEC2的正调控因子PHB/PHV，miR160可能通过ARF10、ARF16与ARF17减弱生长素信号。此外，miR396–GRF调控模块也参与微调生长素响应，可能通过LEC2为中心的SE调控网络发挥作用。长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）已知与Polycomb复合物等染色质修饰因子互作，重塑植物与胚胎干细胞的基因表达程序，因此lncRNAs可能是LEC2介导SE诱导中尚未被探索的调控层次。对SE转录因子活性表观遗传修饰的新认知推动了改善难再生作物再生能力的实验方法发展，包括应用化学表观遗传修饰剂：组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（Trichostatin A, TSA）、PRC2介导H3K27me3沉积抑制剂RDS3434、DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-azacitidine, 5-azaC），这些试剂已在拟南芥与大麦中被证实能提高再生潜能。
LEC2作为体细胞胚胎发生的表观遗传调控因子
越来越多的研究显示转录因子通过表观遗传相关机制调控植物发育基因表达，因此揭示参与建立、维持与擦除表观遗传修饰的转录因子对解析SE复杂调控网络至关重要。近期，关于LEC2介导胚胎发生转换表观遗传机制的研究取得重要进展。全基因组ATAC-seq分析表明，在胚胎发生重编程过程中，LEC2启动广泛的转录级联，与局部生长素稳态及表观遗传重塑紧密偶联，提示转录调控、染色质状态与生长素通路活性之间存在互作。在该机制中，LEC2诱导的早期模式建成蛋白WOX2与WOX3物理招募ATP依赖的SWI/SNF染色质重塑ATP酶SPLAYED至其靶基因启动子（包括数千个胚胎位点），提高这些位点的转录可及性。研究人员进一步提供了LEC2直接参与表观遗传修饰（特别是DNA甲基化）调控SE诱导的证据：LEC2激活从头DNA甲基转移酶DRM2及RNA介导DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation, RdDM）途径的其他组分表达，导致广泛的CHH超甲基化（尤其在靶基因启动子区域）。随后，由SUVH1/3与SDJ蛋白组成的DNA甲基化“读取”复合物被招募至这些超甲基化位点，进而吸引AT-Hook基序核定位（AHL）染色质修饰蛋白。这一级联反应共同提高了染色质可及性，并激活全能性相关基因（包括LEC1、BBM、FUS3转录因子及编码生长素生物合成关键酶的YUC基因）的转录。此外，该模型假设组蛋白乙酰化参与LEC2介导的染色质开放，推测AHL与组蛋白乙酰转移酶（Histone Acetyltransferases, HATs）在LEC2依赖的转录复合物中存在互作；与此一致，组蛋白乙酰化、HAT基因及AHL调控因子在SE诱导中的关键作用已被实验证实。最新数据完善并拓展了生长素诱导胚胎发生转换的分层转录因子级联模型，其中LEC2与LEC1、BBM共同占据中心位置。该模型包含四个调控层级：染色质状态位于顶层，生长素信号与ARF调控因子位于第二层，第三层为生长素诱导的全能性转录因子（包括LEC1、LEC2、BBM），它们调控生长素生物合成与大量胚胎位点，并强化细胞命运转换；第四层为早期模式建成转录因子（如WOX2、WOX3），负责启动体细胞胚形成。该示意图总结了LEC2如何整合激素、表观遗传与代谢信号，重编程体细胞转录组并控制植物细胞全能性。当前观点认为，LEC2既是染色质状态改变的靶点，也是其驱动者，通过直接转录调控与局部生长素稳态介导的间接调控相结合，激活早期与晚期（成熟）胚胎发生基因，从而为SE转换创造许可性染色质景观。值得注意的是，在种子发育中，LEC2被认为既作为经典转录激活因子，又以转录激活非依赖的方式发挥作用；它可与先锋转录因子LEC1互作形成复合物结合DNA并调控染色质可及性，这种LEC1–LEC2复合物是否在SE过程中参与染色质开放仍有待实验验证。尽管LEC2在功能上与先锋转录因子高度相似，但尚未被明确归类为先驱因子，因为与LEC1不同，尚无证据表明LEC2能够结合核小体占据的DNA并自主开放染色质。最新的单细胞分析进一步细化了LEC2启动胚胎发生转换的机制视图：拟南芥子叶表皮细胞中仅气孔谱系的分生母细胞（Meristemoid Mother Cells, MMCs）具有LEC2诱导SE的能力，其胚性潜能来源于谱系特异性调控因子（如SPCH）、全能性相关位点的许可性染色质构型，以及TAA1/YUC4依赖的生物合成与极性生长素运输在瞬时GMC–生长素中间阶段形成的局部生长素微环境。气孔谱系以外的细胞（如 pavement cells或晚期气孔谱系细胞）因缺乏LEC2靶位点的染色质可及性而对重编程不敏感。这些发现表明，LEC2驱动的SE不仅取决于基因激活或生长素水平，还取决于细胞类型特异的染色质状态与谱系背景，它们
