《Acta Parasitologica》：Differential Metabolic and Transcriptional Responses of PBMCs to Blastocystis sp. Subtypes in Chemotherapy-Treated Colorectal Cancer Patients
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目的：芽囊原虫（Blastocystis sp.）是一种机会性肠道原生生物，常与结直肠癌（CRC）相关。其在化疗处理的结直肠癌免疫抑制环境中的免疫调节作用在很大程度上仍未被探索。本研究旨在调查来自亚型ST1–ST5的芽囊原虫溶解性抗原（BSA）对外周血单核细胞
目的：芽囊原虫（Blastocystis sp.）是一种机会性肠道原生生物，常与结直肠癌（CRC）相关。其在化疗处理的结直肠癌免疫抑制环境中的免疫调节作用在很大程度上仍未被探索。本研究旨在调查来自亚型ST1–ST5的芽囊原虫溶解性抗原（BSA）对外周血单核细胞（PBMCs）代谢活性和细胞因子基因表达的影响。
方法：研究人员从健康供体（HDs；n=5）和接受基于5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗的CRC患者（CRCPs；n=5）中分离PBMCs，后者在化疗周期后7–14天采样以捕获治疗最低点（nadir）。PBMCs用BSA（0.001–30 μg/ml）攻击48小时。通过MTT法评估代谢活性，并使用实时反转录PCR（real-time RT-PCR）评估细胞因子（IL-6、IL-8、TGF-β、IFN-γ、TNF-α）的转录谱。
结果：HD PBMCs表现出双相代谢响应，在BSA浓度超过10 μg/ml时转变为显著刺激。相反，CRCP PBMCs在所有浓度下显示出显著减弱的、主要为抑制性的代谢谱（p < 0.001），尽管其对植物血凝素（PHA）保持活力。在转录水平上，HDs显示出效应因子和促肿瘤转录本的平衡上调。相比之下，CRCP队列表现出广泛的转录钝化。值得注意的是，在CRCPs中，亚型ST3是一个明显的异常值，独特地诱导了强健的IFN-γ和TNF-α表达（p < 0.01），可与HDs相媲美。
结论：虽然化疗诱导全身低反应性，但ST3拥有独特的免疫原性属性，可绕过免疫抑制。这种转录逃逸可能促进有利于CRC进展的不平衡炎症环境。
本文解读的论文《Differential Metabolic and Transcriptional Responses of PBMCs to Blastocystis sp. Subtypes in Chemotherapy-Treated Colorectal Cancer Patients》发表在寄生虫学领域期刊《Acta Parasitologica》上。
研究背景：
芽囊原虫（Blastocystis sp.）是一种普遍存在的肠道原生生物，在全球约十亿人肠道中定殖，传统上被视为共生生物，但近期其在结直肠致癌中的作用受到广泛关注。该寄生虫经常在结直肠癌（CRC）患者的粪便样本中被检测到，并常作为机会性感染出现在活跃化疗周期期间。尽管有实验证据表明芽囊原虫可通过上调干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎细胞因子引发强烈的细胞免疫反应，且其半胱氨酸蛋白酶被认为参与激活NF-κB信号通路，但这种病理潜能似乎高度依赖亚型，例如ST7以其强效促炎作用著称，而ST3（ST3）则是CRC队列中最普遍的基因型，既往研究显示其溶解性抗原能显著加剧恶性HCT116细胞的增殖并上调组织蛋白酶B等促肿瘤因子。此外，芽囊原虫可能通过诱导氧化应激（如升高的脂质氢过氧化物LHP和晚期氧化蛋白产物AOPP）损害宿主免疫监视，并可能直接干扰化疗疗效，如降低5-氟尿嘧啶（5-FU）的抑制效力。CRC的标准护理化疗（包括FOLFOX和Mayo方案）会引起深刻的全身免疫抑制，抗代谢药如5-FU和铂类药物导致外周血单核细胞（PBMCs）的DNA损伤，致使效应T细胞活性减弱和先天反应受损。在这种免疫抑制环境中，芽囊原虫的免疫调节作用尚未明确，因此研究人员开展了此项研究，旨在评估芽囊原虫溶解性抗原（BSA）对健康供体和化疗处理的CRC患者PBMCs的代谢活性及细胞因子基因表达的细胞调制作用，以阐明化疗诱导的微环境如何改变宿主防御能力，并探究如临床普遍的ST3等亚型是否具备绕过全身抑制的独特免疫原性属性。
主要关键技术方法：
研究人员招募了5名健康供体（HDs）和5名接受基于5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗（FOLFOX或Mayo方案）的结直肠癌（CRC）患者（CRCPs，AJCC III期和IV期），CRCPs血样严格在标准化疗周期后7–14天（治疗最低点，nadir）采集。从粪便样本中分离并培养芽囊原虫，通过PCR使用序列标记位点（STS）引物进行亚型鉴定（ST1–ST5），随后制备各亚型溶解性抗原（BSA）。从两组外周血中通过密度梯度离心法分离外周血单核细胞（PBMCs），用不同浓度BSA（0.001–30 μg/ml）刺激48小时，以Jones’培养基为阴性对照、植物血凝素（PHA）为阳性对照；通过MTT法检测代谢活性（595 nm吸光度），并通过实时RT-PCR（采用TaqMan探针，以内参基因β-actin即ACTB标准化）检测IL-6、IL-8、TGF-β、IFN-γ和TNF-α的mRNA表达水平，数据用SPSS进行双向ANOVA及Student's t检验等统计分析。
研究结果：
Results（结果）：
研究人员用不同浓度BSA（0.001至30 μg/ml）处理PBMCs，两组队列产生了明显的代谢谱。HD组PBMCs表现出双相代谢响应：在低浓度（0.001–1.0 μg/ml）时代谢活动接近基线或略有抑制，但在浓度超过10 μg/ml时观察到活性显著增加（p < 0.01），且健康队列内不同芽囊原虫亚型（ST1–ST5）间未观察到代谢活动的显著差异（p > 0.05）。相反，CRCP组在所有测试浓度下均表现出显著减弱且主要为抑制性的代谢响应（p < 0.001，双向ANOVA），代谢活动持续低于基线（Jones’培养基对照），未显示统一的剂量-响应关系；有丝分裂原PHA（8 μg/ml）在HDs和CRCPs中均诱导了强健且显著的代谢活动增加（p < 0.01）。
为了研究对BSA的转录响应，研究人员对来自代表性健康供体（HD）和化疗处理的CRC患者（CRCP）的PBMCs进行了实时RT-PCR。在暴露于30 μg/ml的ST1–ST5亚型BSA 48小时后，观察到不同的调节和效应转录本表达模式。健康供体样本显示出所有五个芽囊原虫子型的基因转录本普遍上调（p < 0.05），所有亚型均诱导显著转录本表达，折叠变化值约为2.0至超过4.5，其中ST1和ST4引发了最显著的IL-8响应，所有亚型一致观察到3.0至4.0倍的增加，表明健康免疫环境中有效的炎症激活。与健康队列相反，代表性CRCP样本对大多数细胞因子和亚型显示出显著钝化的转录谱，对于ST1、ST2、ST4和ST5，调节基因表达的诱导基本缺失，折叠变化值保持在1.0附近或低于1.0。然而，观察到了独特的亚型特异性相互作用：尽管整体环境钝化，ST3在CRCP样本中仍是强效刺激物，在效应基因谱中，ST3诱导了IFN-γ（3.0倍）和TNF-α（3.3倍）的显著表达，均具有统计学意义（p < 0.01），可与健康供体水平媲美；在调节转录本谱中，ST3是唯一引发IL-6显著诱导（2.0倍，p < 0.05）的亚型，而其他亚型未能达到显著的激活水平。
讨论（Discussion）总结：
研究结果表明，HDs和CRCPs对芽囊原虫抗原的差异免疫反应，关键性地揭示了恶性肿瘤及化疗相关的免疫抑制如何改变宿主-寄生虫相互作用。HD队列中PBMCs的特征性双相代谢响应（低浓度抑制到高浓度超过阈值后的激活）与既往证据一致，表明寄生虫基于刺激浓度引发不同病理生理事件；而CRCP组在所有测试浓度下显著减弱且主要抑制的代谢响应，反映了全身免疫低反应状态，使患者易受机会性定殖。PHA在两组中引发的有效响应证实CRCP中PBMCs仍保持功能活力，其对寄生虫抗原的反应减弱是特定免疫调节或激活阈值升高所致，而非化疗导致的广义细胞功能丧失。在转录水平，HD样本表现出IL-6、IL-8、TGF-β、IFN-γ和TNF-α的平衡且强健的上调，与NF-κB通路激活有关；而CRCP样本表现出与队列代谢低反应性一致的广泛转录钝化，大多数亚型（ST1、ST2、ST4、ST5）基因转录诱导极小或缺失，这种“沉默”谱表明CRC环境下的芽囊原虫感染倾向于产生对抗保护性免疫响应的抵抗，可能通过诱导免疫細胞耗竭状态从而促进其存活和传播。尽管存在这种广义抑制，CRCP样本中ST3表现出显著亚型特异性交互作用，其维持了引发强健效应转录本（IFN-γ和TNF-α）的能力，达到与健康供体相当的水平；数据表明ST3可能独特拥有能够覆盖该抑制的分子特征，这种转录逃逸为ST3在细胞机制被细胞毒性治疗沉默时仍对宿主免疫“可听”提供了潜在解释，并且该效应转录逃逸发生在治疗最低点，与ST3作为高致病潜能亚型的表征一致。此外，CRCP样本中缺乏代偿性调节响应（TGF-β），表明ST3诱导的炎症在没有健康个体体内稳态平衡的情况下发生，这种促炎标志物在受损宿主中的显著上调（特别是与凋亡标志物下调耦合时）可能矛盾地促进结肠癌细胞生长并增强肿瘤进展。芽囊原虫的存在还可能直接干扰化疗疗效，其抗原通过上调Nrf2和TGF-β等基因降低5-FU抑制效力达26%–32%，为癌细胞提供细胞保护优势；CRCPs中细胞因子表达降低（尤其是TGF-β代偿性调节响应缺失）表明癌症环境中的存活细胞正在经历有利于肿瘤生存的“应激诱导激活”。机制上，芽囊原虫加剧致癌作用可能由持续氧化应激和组织损伤驱动，体内模型显示感染与蛋白氧化（AOPP）和脂质过氧化（LHP）显著增加相关，触发DNA加合物形成并加速肿瘤发展，伴随绒毛局灶性钝化和粘膜脱落，进一步降低宿主吸收消化功能，可能恶化已受化疗损害的患者的临床状况。研究局限性包括缺少未治疗CRC组，因此观察到的差异不能单独归因于化疗，也可能受恶性肿瘤、疾病分期、肿瘤负荷和患者特定临床变量影响；此外小样本量（n=5）及基因表达分析使用代表性个体也是限制因素，但ST3作为坚韧异常值的识别为进一步研究癌症患者中芽囊原虫免疫调节提供了强力“参考点”。
结论（Conclusion）翻译：
总之，本研究表明芽囊原虫溶解性抗原施加了高度依赖宿主临床状态的深刻免疫调节影响。虽然健康供体的PBMCs显示出强健的双相代谢响应和平衡的细胞因子上调，但CRC队列表现出以显著转录钝化为特征的全身低反应状态。这种对比反映了个体在5-FU基化疗诱导的免疫抑制微环境中的脆弱性。最重要的发现是ST3亚型的独特韧性，即使宿主免疫机制在其他方面被沉默，其仍保持了引发强效效应转录本驱动响应的能力。
