利用集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）位点定向诱变（site-directed mutagenesis）调控光系统II（PSII）的F695荧光态

《Photosynthesis Research》：Tuning the F695 fluorescent state in photosystem II using site-directed mutagenesis in Synechocystis sp. PCC 6803

　　

在光合蛋白中，处于较高能级的色素将激发能传递给较低能级的色素。具体而言，在光系统II（PSII）中，能量以“下坡”方式传递到反应中心（RC），从而发生水裂解析氧反应。然而，PSII中的最低能态并非反应中心，而是F695态，该态可通过低温光谱进行观测。这一最低能态通常被归属于一个单体色素，即叶绿素B16（Chl B16，由His114配位），但基于低温光谱的理论拟合结果对此归属提出了质疑。在本研究中，研究人员旨在通过位点定向诱变（site-directed mutagenesis）与77 K荧光光谱技术，具体验证F695态是否定位于Chl B16上。为了降低全细胞PSII研究中的光谱拥堵程度，研究人员开发了一个背景菌株（PSI-kd/ΔPBS），该菌株结合了光系统I（PSI）敲低（knockdown）与藻胆体（PBS）敲除（knockout）。在该背景菌株中，研究人员对PsbH亚基的Thr5位点进行了位点定向突变，该位点与一个氢键相连，此氢键作用于Chl B16的131-酮基（131-keto group）。所有突变体均能够进行异养生长（与野生型相比无明显差异），表明PSII功能保持完整。正如Chl B16定位荧光所预期的那样，Thr5→Arg突变由于氢键的增强使得F695态红移，而Thr5→Ala突变由于氢键的消除表现出蓝移。综上所述，这些发现有力证实了Chl B16是负责最低能态的色素。

本研究论文发表于《Photosynthesis Research》，围绕光系统II（PSII）中最低能量荧光态F695的起源这一长期争议的科学问题展开。在PSII中，激发能通常沿“能量漏斗”向下传递至反应中心（RC）以驱动水的裂解，但77 K低温荧光光谱揭示其最低发射态并非来自反应中心，而是一个位于约695 nm处的F695态，且传统上被认为源自CP47天线复合体中的单体叶绿素a——叶绿素B16（Chl B16，由CP47的His114配位）。然而，近年来的多项理论模拟研究（如基于空穴燃烧光谱、圆偏振发光光谱的拟合）对此传统归属提出了挑战，认为Chl B13、Chl B1或其他色素可能是F695的起源，亦有研究指出以往使用的His114配体突变或PsbH亚基缺失突变可能引发复杂的非特异性整体结构扰动，而非特异性地改变B16位点性质，从而导致归属的不确定性。此外，以往使用分离的CP47复合物进行光谱研究时，样品制备的差异（如缺乏PsbH亚基）本身就可能引起F695峰的位移或丢失，进一步增加了争议。因此，研究人员亟需一种更为正交且最小扰动的实验手段，直接在完整的细胞环境中明确F695态的色素起源，这对深入理解PSII的激发能传递、红移态功能（如光保护）及色素-蛋白相互作用的精细调控机制具有重要意义。

为开展此项研究，研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：以模式蓝细菌集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）为研究对象，首先通过基因工程手段构建了独特的背景菌株PSI-kd/ΔPBS，即结合铜可抑制启动子（PpetJ）替换PSI原生启动子实现PSI的诱导敲低（knockdown），并依次敲除藻胆体（PBS）相关的cpcBD、apcAC及apcE基因以实现PBS完全缺失，从而在全细胞77 K荧光测量中消除PSI（~722 nm）和PBS（~640-660 nm）的干扰信号；随后在该背景及野生型等背景下，利用位点定向诱变（site-directed mutagenesis）将PsbH亚基Thr5位点分别突变为Ala、Arg、Ser、Lys、His、Asp和Glu共7种氨基酸；通过异养及自养生长测试评估PSII功能完整性，利用77 K荧光光谱（450 nm激发，液氮温度）检测突变引起的F695峰位与强度变化，并利用清晰天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（CN-PAGE）分析类囊体膜中PSII二聚体/单体比例以评估突变对复合体组装的影响。

研究结果如下：

Introduction（引言）：研究人员介绍了光合生物能量转换效率的限制因素及天线截断策略的利弊，指出精确调控单个色素性质需明确野生型中各色素的作用。详细阐述了PSII中F695态的发现历史、传统上归属于Chl B16（CP47中由His114配位的叶绿素）的依据（如His114突变导致F695丢失或位移、振荡强度对应约1个叶绿素等），以及后续理论模拟研究提出的替代候选色素（Chl B13、Chl B1等）和关于以往突变研究可能存在非特异性结构扰动的质疑，从而引出本研究采用PsbH-Thr5位点定向诱变以最小扰动地验证B16归属的动机，并说明了构建PSI-kd/ΔPBS背景菌株以净化PSII荧光信号的思路。

Methods（方法）：研究人员描述了所用集胞藻野生型及衍生菌株（PSI-kd、ΔPBS、PSI-kd/ΔPBS）的构建方式，包括PSI-kd通过替换psaAB启动子为铜可抑制启动子PpetJ实现，ΔPBS通过依次敲除cpcBD、apcAC和apcE基因实现；说明了PsbH Thr5位点的7种位点定向突变的引入方法；列出了菌株培养条件（BG-11培养基、葡萄糖补充、特定抗生素等）及铜浓度依赖的PSI抑制实验条件；介绍了类囊体膜的分离制备与叶绿素浓度测定方法、清晰天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（CN-PAGE）分析PSII组装的方法，以及77 K荧光光谱的测量设置（样品于40%甘油中、450 nm激光激发、光谱仪检测与CCD校正等）和峰位确定方式。

Results（结果）：研究人员首先指出，在野生型背景下，Thr5的7种突变均导致F695带发生变化（仅T5S和T5R能清晰分辨，其余表现为强度降低或蓝移肩峰），但受PSI（722 nm）和PBS（640-660 nm）荧光干扰难以明确。ΔPBS菌株消除了PBS荧光但相对增强了PSI信号；而PSI-kd/ΔPBS菌株在加铜条件下实现了PSI的有效抑制，使PSII的F685和F695带清晰可辨。在该优化背景下，突变体的77 K荧光结果显示：T5S（丝氨酸，保守突变）基本保持WT的F695峰位与相对强度，仅轻微宽化；T5R（精氨酸，更强氢键供体）导致F695峰红移约1.5 nm（至695.29 ± 0.18 nm）且强度略有增加；T5A（丙氨酸，消除氢键）导致F695峰蓝移约2 nm（至近692 nm）且强度明显降低；T5K、T5H、T5D、T5E四个突变体的F695带不再作为独立峰可见（可能源于强度丧失或位移，其中T5D可见694 nm处微弱肩峰，T5E和T5K可见近690 nm极弱特征）。CN-PAGE结果显示，除T5H几乎完全为单体、T5E二聚体比例略降外，其余突变体PSII二聚体/单体比与野生型相近，表明多数点突变未严重破坏PSII组装。

Discussion and conclusions（讨论与结论）：研究人员总结认为，PsbH Thr5位点的点突变结果（特别是T5R、T5S、T5A在清晰背景下的峰移趋势：T5R > WT ≈ T5S > T5A）为F695态定位于Chl B16提供了明确支持。该策略通过修饰单一氢键相互作用而非删除配基或亚基，降低了非特异性结构扰动的可能性；且观测到的位移趋势符合氢键强度与叶绿素Q_y跃迁能的已知关系（强氢键稳定激发态、缩小HOMO-LUMO间隙、红移；断氢键则蓝移），难以用巧合的非局部变化解释。对于T5K、T5H、T5D、T5E中F695信号弱化，研究人员推测可能与电荷侧链干扰色素结合或空间位阻有关（得到CN-PAGE中T5H二聚化受损的支持），而T5K的异常行为可能源于额外重排。研究人员讨论了以往部分模拟研究归属分歧的可能原因：使用分离的、可能缺乏PsbH的CP47样品，而PsbH-Thr5氢键对完整F695带的形成至关重要，缺乏该亚基/氢键可能改变最低能态色素。研究人员也指出，氢键修饰仅能解释F695相对于平均PSII吸收（~675 nm）约20 nm红移中的约4 nm（±2 nm），表明Chl B16的独特取向（与CP43中对称等效色素C13相比翻转180°、His配基从相反侧接近）导致的环系统变形等因素也可能贡献了其红移。此外，该结果支持了远红适应PSII中Thr5天然替换为Ala会导致Chl B16跃迁蓝移的提议。最后，研究人员认为所构建的PSI-kd/ΔPBS菌株生长快，适用于未来不需完全消除PSI的PSII光谱研究。

综上，该研究通过集胞藻PsbH亚基Thr5位点的系统性点突变与背景荧光信号净化，以最小扰动的方式证实了光系统II中77 K下F695最低能量荧光态起源于CP47天线复合体的叶绿素B16（Chl B16），其氢键环境（特别是与Thr5的氢键）可调控该态的能级位置，为理解PSII的红移态起源、色素-蛋白相互作用的功能及以往争议提供了清晰的实验结论。