脂质纳米粒中脂质比例的重审：单因素轮换法与实验设计法的比较研究

《Drug Delivery and Translational Research》：Revisiting the lipid ratio in lipid nanoparticles: A comparison of OFAT and design of experiments approaches

　　

尽管脂质纳米粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）已在临床取得显著成功，其配方优化仍主要依赖继承的脂质比例及筛选策略，这些方法未能充分捕捉组成成分与制造工艺的综合影响。本研究应用单因素轮换法（One-Factor-at-a-Time, OFAT）与实验设计法（Design of Experiments, DoE）探讨脂质摩尔比例如何影响关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）及信使核糖核酸（mRNA）的表达水平。同时，研究人员比较了手动执行与自动化微流控制造方法，以评估其对配方—性能关系的影响。在所有策略中，除标准摩尔比例外，多种配方均获得了可比较的物理化学性质，包括粒径小于120 nm、低多分散指数（Polydispersity Index, PDI＜0.2）及高包封效率（＞75%）。手动与自动化微流控制造的DoE配方在CQAs及表达谱上存在差异，表明组成成分与工艺条件共同影响配方性能。DoE分析揭示了脂质组成与CQAs之间存在非线性且依赖于工艺的关系，在所探索的设计空间内预测能力有限，尤其在生物输出方面。OFAT与DoE数据集的比较表明，OFAT可在受限设计空间内识别方向性趋势，而DoE能提供更广泛的相互作用效应及配方权衡信息。总体而言，这些发现表明传统脂质比例是一种稳健但并非最优的配方，支持向依赖情境、设计空间驱动的LNP系统优化转变。

研究背景与意义

脂质纳米粒（LNPs）是当前临床应用最成熟的核酸递送载体，已成功用于小干扰RNA（siRNA）及信使RNA（mRNA）药物的递送，例如Onpattro、Spikevax及mRESVIA等。现有配方大多沿用早期siRNA-LNP的脂质组成和摩尔比例，缺乏针对mRNA递送的系统优化。当前关键质量属性（CQAs）的接受标准主要依据肝靶向需求设定，限制了在非肝组织递送中的灵活性。此外，传统优化多采用单因素轮换法（OFAT），难以揭示多组分间的相互作用，也无法全面反映工艺条件对配方性能的影响。因此，研究人员开展本研究，以直接比较OFAT与实验设计法（DoE）在相同LNP系统中的表现，并评估手动与自动化微流控制造对配方—性能关系的影响。该研究发表于《Drug Delivery and Translational Research》，旨在为LNP配方优化提供更科学、系统的策略。

主要技术方法

研究采用两种优化策略——OFAT与DoE，分别结合手动和自动化微流控混合平台制备LNP。OFAT在固定PEG化脂质比例的前提下，分别改变磷脂DSPC或离子化脂质SM-102的含量，并以标准配方为基准。DoE则采用混合设计，在总脂质比例为100%的约束下，同时调整DSPC、胆固醇、SM-102及DMG-PEG₂₀₀₀的比例，生成19种配方并额外纳入标准配方作为对照。物理化学表征包括粒径、多分散指数（PDI）、ζ电位及包封效率测定，生物学评价涵盖体外细胞转染、无细胞蛋白表达及小鼠体内生物发光成像。自动化DoE批次还进行了脂质回收率与组成的HPLC-ELSD定量验证。

研究结果

The impact of molar ratio on LNP physicochemical properties

OFAT结果显示，多数配方在80–120 nm范围内获得稳定粒径和低PDI，且包封效率高于90%。去除胆固醇会导致PDI升高，完全去除离子化脂质则显著降低包封效率。

The in vitro in vivo efficacy of down-selected LNPs

在标准比例下，体外与体内表达最高。减少胆固醇或无胆固醇配方表达下降，去除DSPC不影响表达但降低稳定性，离子化脂质含量过低会显著削弱表达。部分配方在体内注射部位与肝脏表达存在差异，且在6小时时间点表达趋于收敛。

Loss of functional activity is not caused by a loss of component integrity

HPLC-ELSD定量分析显示各配方脂质回收率均在80%以上，组成与目标比例基本一致，排除成分降解导致的功能差异。

Rationale for transition from OFAT to DoE

OFAT虽能界定配方可接受范围，但无法解析组分间相互作用。DoE可在更广的设计空间内揭示非线性响应关系，并量化交互效应。

Composition–response relationships in manual DoE LNPs (mLNPs)

Cox响应轨迹图显示，DSPC与SM-102比例增加倾向于增大粒径，胆固醇与DMG-PEG₂₀₀₀增加则减小粒径。胆固醇提高可增强包封效率与表达，SM-102呈U型关系，DMG-PEG₂₀₀₀主要影响粒径与PDI。

Modelling the characteristics of manual DoE LNPs (mLNPs)

轮廓图进一步可视化了组成—响应关系，显示DMG-PEG₂₀₀₀对粒径与PDI影响显著，但对ζ电位、包封效率及表达影响有限。模型对粒径与PDI具一定拟合度，但对生物输出的预测能力较弱。

Validating mLNP DoE as a predictive model

对OFAT配方的预测准确性有限，仅部分CQAs可较好预测，整体模型无法稳健验证。

Composition–response relationships in automated DoE LNPs (aLNPs)

自动化平台获得的趋势与手动平台总体一致，但在胆固醇对粒径的影响方向上存在差异，且整体ζ电位略偏正。生物输出仍呈非线性，胆固醇增加提升表达，SM-102减少有利于体内表达。

Modelling the characteristics of automated DoE LNPs (aLNPs)

自动化模型的粒径预测准确性显著提升（R²=81.74%），包封效率与PDI中等可预测，生物输出预测仍有限。

讨论与结论翻译

讨论指出，标准脂质比例虽稳健但并非最优，LNP性能由多组分平衡决定而非单一比例。OFAT适合界定边界与趋势，DoE能揭示交互作用与权衡关系，但即便在自动化条件下，生物输出的预测能力仍不足。这提示配方优化需同时考虑组成、工艺与生物环境。研究支持从固定比例转向基于设计空间的优化策略，并结合质量源于设计（Quality-by-Design, QbD）理念。

结论翻译：

本研究表明，传统脂质比例是一个稳健的起点，但在更广泛且灵活的设计空间中并非最优配方。多种组成均可实现相似的理化性质与生物性能，说明LNP行为取决于组分平衡而非单一固定比例。虽然DoE能够探索OFAT无法揭示的交互效应与权衡，但其预测能力有限，尤其对生物输出，并受到配方与工艺条件的双重影响。这些结果凸显了配方映射与预测能力之间的脱节。未来LNP优化应从固定比例转向整合组成、工艺及生物情境的设计空间驱动策略。