《Immunogenetics》：Identification of gene conversion events in horse IGHV suggests preferential hotspots for diversification
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体液免疫应答依赖多样化的抗体库，该库可通过体细胞高频突变（somatic hypermutation, SHM）、类别转换重组（class?switch recombination, CSR）及基因转换（gene conversion, GC）等过程扩增。这些
体液免疫应答依赖多样化的抗体库，该库可通过体细胞高频突变（somatic hypermutation, SHM）、类别转换重组（class?switch recombination, CSR）及基因转换（gene conversion, GC）等过程扩增。这些过程主要由激活诱导胞苷脱氨酶（activation?induced cytidine deaminase, AID）介导。基因转换可在鸡、兔等物种中生成免疫球蛋白重链和轻链（IGHV）的多样性，但其研究尚不充分。由于80%的马IGHV库仅来源于三个功能性基因片段，研究人员检测了马体内基因转换事件以评估其在抗体多样化中的作用。通过使用优化后的BrepConvert软件（分析时间显著缩短），研究人员在6.9%的免疫球蛋白序列中鉴定到基因转换事件。结果显示存在局部偏好性，多数事件发生在框架区1（framework region 1, FR1）起始端及互补决定区2（complementarity?determining region 2, CDR2）内。假基因IGHV4?35、IGHV4?53和IGHV4?38被利用的频率最高，而功能基因IGHV4?21、IGHV4?22和IGHV4?29的事件频率最高。值得注意的是，虽然大多数错配区域仅为3个核苷酸长，但91%的这些事件侧翼存在特定序列（5′端6个核苷酸和3′端1个核苷酸）。此外，功能基因?假基因配对常共享5–26个核苷酸相同的先导区（leader region），提示存在延伸事件。研究人员还发现这些事件可能与局部非B型DNA构象以及锌指蛋白ZNF691存在潜在关联，支持DNA结合因子参与该过程。综上，这些发现表明基因转换通过靶向特定IGHV区域，对马抗体多样性具有重要贡献。
研究背景
马长期以来被用于抗毒素、抗蛇毒血清及抗病毒治疗性血清的生产，是生物制品领域的重要资源。然而，马的免疫球蛋白基因组组织与多样性产生机制研究相对滞后。已知马免疫球蛋白重链（IGH）位点包含104个IGHV基因，其中仅21个为功能基因，假基因数量约为功能基因的三倍。前期研究表明，超过80%的马IGHV库由仅三个功能基因片段贡献，提示传统V(D)J重排并非其主要多样性来源。在鸡、兔等物种中，假基因可通过基因转换（gene conversion, GC）向功能基因导入序列，是抗体多样性的核心机制。鉴于马IGHV位点存在大量假基因且功能基因使用高度受限，研究人员推测基因转换可能同样参与马抗体库的多样化过程，但该假说缺乏系统性验证。
技术方法
研究人员收集了8匹健康混合品种马的外周血单个核细胞（PBMC）样本，其中4个样本来自既往研究队列，其余4个为新采集样本。提取总RNA后，采用多重PCR扩增IGHV区，经Illumina MiSeq平台进行高通量测序。原始数据经Immcantation流程质控后，使用IMGT/HighV?QUEST进行胚系基因注释。为提升分析效率，研究人员对原有BrepConvert软件进行了多线程序列比对优化，并引入基因位置过滤策略，仅保留位于功能基因上游的假基因作为候选供体，排除因基因组位置不合理导致的假阳性结果。在此基础上，系统分析了基因转换事件的序列特征、空间分布及调控元件。
研究结果
马抗体库中基因转换事件的鉴定
优化后的BrepConvert将每千条序列的分析时间从约5小时缩短至44分钟。在总计754,233条高质量IGHV序列中，平均每个个体有4,402条序列（占总唯一序列的6.90%）检测到基因转换事件，证实该机制在马抗体库中广泛存在。
马IGHV基因转换相关错配区域的特征
错配区域长度范围为3至251个核苷酸，其中约60%仅为3个核苷酸。约60%的错配区域与其最接近假基因的Levenshtein距离为0，表明序列完全一致。74%的基因转换事件邻近AID基序（motif），且多位于FR1区。进一步分析显示，94.4%的AID热点区域与基因转换错配区无重叠，仅0.01%的错配区完全位于AID热点内，排除了这些短错配是体细胞高频突变聚集事件的可能性。
基因转换事件中功能基因与假基因的偏好性
IGHV4家族是基因转换的主要参与者。功能基因中，IGHV4?21、IGHV4?22和IGHV4?29的事件频率最高；假基因中，IGHV4?35、IGHV4?53和IGHV4?38最常作为供体。尽管这些功能基因与假基因的整体序列一致性仅为60%–68%，低于经典模型预期的80%，但仍频繁发生基因转换。
基因转换事件延伸的证据
研究发现91%的3核苷酸错配事件侧翼存在保守序列：5′端6个核苷酸与假基因完全相同，3′端1个核苷酸相同。若将侧翼保守区计入，实际转换长度可达10–12个核苷酸。进一步比对显示，功能基因与假基因的先导区存在5–26个核苷酸的相同序列，提示基因转换可延伸至先导区，总长度为15–36个核苷酸，表明常规检测低估了真实事件规模。
非B型DNA构象在基因转换热点富集
含有基因转换事件的序列中，直接重复（Direct Repeats, DR）和滑移基序（Slipped motifs）的频率显著高于无事件序列。这些基序集中分布于V区起始端，与基因转换高发区重合，提示非B型DNA构象可能通过促进DNA双链断裂参与重组。
延伸基因转换事件侧翼基序的鉴定
在延伸事件的下游（3′端）鉴定到保守基序AAGGAGTC，该基序与锌指蛋白ZNF691的预测结合位点高度相似，暗示ZNF691等DNA结合因子可能参与调控基因转换的修复过程。
讨论与结论
本研究首次系统证实了基因转换是马抗体多样性的重要机制。与鸡、兔不同，马的基因转换偏好发生于FR1区而非CDR区，且可在较低整体序列一致性下通过局部同源序列介导完成。短错配事件实为更长转换片段的最小可检测单元，且与非B型DNA构象及ZNF691相关。这一发现揭示了马免疫系统的独特多样性策略，为理解物种特异性免疫进化提供了新视角，也为基于马源的抗体工程与疫苗设计奠定了理论基础。研究发表于《Immunogenetics》。
