基于荧光成像与深度学习方法的乙型肝炎病毒基因组整合检测技术

《Journal of Imaging Informatics in Medicine》：A Fluorescence Imaging- and Deep Learning-Based Approach for Detecting Hepatitis B Virus Integration into Host Genomes

　　

慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染可诱发肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），在慢性HBV携带者肝脏中常观察到HBV整合入宿主基因组的现象，并被认为可能触发致癌过程。现有PCR（Polymerase Chain Reaction）类方法虽灵敏度较高，但受限于整合位点差异，检测效果不稳定；高通量测序（high-throughput sequencing）虽可同时明确整合位点，但成本过高，难以在临床广泛应用；原位杂交（in situ hybridization，ISH）可在单细胞水平检测DNA与RNA，但尚未用于HBV整合检测，主要难点在于整合型HBV基因组拷贝数低，导致信噪比不足。研究人员开发了一种荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）方法，用于在单细胞水平检测肝细胞的HBV整合状态，并结合深度学习模型对细胞图像进行分析。利用多个含或不含整合HBV DNA的肝癌细胞系验证显示，训练后的神经网络在大多数阳性和阴性对照细胞中准确率超过90%。该研究首次概念验证了荧光成像结合深度学习在单细胞水平检测HBV整合的可行性。

本研究由研究人员发表于《Journal of Imaging Informatics in Medicine》，聚焦于解决HBV整合检测在单细胞层面的技术瓶颈。HBV整合是慢性HBV感染致肝细胞癌的关键分子事件，约90%的HBV相关HCC病例中存在该现象，但其发生频率在单个肝细胞中低于1%，传统方法存在明显局限：Southern blot灵敏度仅能检测10³—10⁵拷贝以上的HBV基因组；Alu-PCR依赖整合位点邻近Alu重复序列，适用范围受限；Inverse PCR需邻近限制性酶切位点，同样存在盲区；新一代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）成本高昂，难以临床普及。荧光原位杂交（FISH）可在单细胞水平实现核酸检测，但HBV基因组仅约3.2 kb，传统大片段探针难以有效识别，且整合拷贝数低导致信号弱、背景噪声高，此前从未成功应用于HBV整合检测。因此，研究人员提出将高灵敏度分支扩增FISH与深度学习图像分析相结合的新策略，以实现低成本、高精度的单细胞HBV整合检测。

关键技术方法方面，研究人员使用了五种细胞系作为实验模型，包括已知携带整合HBV DNA的HepAD38与Hep3B细胞系、不携带整合HBV DNA的HepG2与HCI-H1299细胞系，以及诱导HBV基因表达的HepAD38+RNA细胞系。采用针对HBV基因组负链设计的ZZ探针结合分支DNA扩增技术进行FISH染色，通过严格洗涤去除未整合游离HBV DNA以减少非特异性信号。图像采集使用高内涵成像系统获取单细胞荧光图像，数据集标注以细胞系生物学属性作为绝对金标准，避免人工标注的主观偏差。深度学习流程分为两步：首先使用YOLOv5x模型进行细胞核识别与裁剪，其次采用EfficientNet B0作为主干网络进行HBV整合分类，并通过数据增强与五折交叉验证防止过拟合。

研究结果部分分为以下小节：

Liver Cells for Evaluating the FISH Approach——研究人员选用多种肝细胞系模拟临床样本的生物学异质性，其中HepAD38代表高拷贝整合场景，Hep3B代表低拷贝整合场景，HepAD38+RNA模拟活跃转录导致的胞质背景噪声，HepG2与HCI-H1299作为阴性对照。

Fluorescent Images of Cell Lines——FISH成像结果显示阳性细胞系核内可见红色荧光斑点，阴性对照HepG2斑点较少，但HCI-H1299却出现与阳性细胞相近的信号强度，证明单纯依靠荧光强度阈值无法可靠区分整合状态，凸显背景噪声的挑战性。

Deep Learning for Detecting HBV Integration——YOLOv5x模型经迁移学习后，在肝细胞系中的细胞核识别计数结果与商业软件高度一致。基于EfficientNet B0的分类模型在第一批次HepAD38与HepG2测试集上达到auROC 97.3%、auPRC 95.5%，单细胞和全视野水平均实现高精度区分。在HepAD38+RNA场景中性能略有下降但仍保持稳健，而在低信号强度的Hep3B场景中召回率明显降低，但在严格洗涤与信号增强的第二批次实验中性能显著提升。

Cross Batch Performance——跨批次测试表明，模型在实验条件调整后的第二批数据中仍保持良好泛化能力，HepAD38与HepG2区分的auROC达95.8%；在低信号Hep3B细胞中，第二批的召回率从第一批的42.6%提升至71.0%，证明优化实验条件可改善低拷贝整合的检测效果。

讨论部分指出，与传统商业软件相比，深度学习模型能够克服高背景噪声干扰，显著减少假阳性。尽管严格洗涤可降低背景，但也会削弱真实信号，因此引入深度学习处理实验波动更具实用价值。Hep3B与HepAD38虽均为单拷贝整合，但信号差异提示除拷贝数外，还存在其他影响荧光强度的因素，未来可通过多细胞类型联合训练提升鲁棒性。虽然单细胞准确率尚未完美，但通过多细胞聚合判断可实现极高置信度的群体整合检测，这对早期HCC中稀有整合细胞的发现具有重要意义。研究局限性在于尚未在真实临床组织样本中验证，且培养细胞与组织细胞的密度及组成存在差异，未来需进一步优化组织适配方案。

结论部分表明，该研究首次验证了FISH成像结合深度学习在单细胞水平检测HBV整合的可行性，模型在不同实验批次与细胞背景下均表现出良好的稳定性，为未来临床HBV整合检测提供了新的技术路径。