甲基化人类游离DNA候选参考材料的开发、表征及实验室间验证

《Clinical Epigenetics》：Development, characterization, and inter-laboratory validation of methylated human cell free DNA candidate reference materials

摘要

背景

异常DNA甲基化生物标志物在早期癌症检测、多癌症检测以及确定组织来源方面显示出潜力。由于循环游离DNA（cfDNA）的稳定性、高频率以及在体液中的易获取性，其甲基化成为液体活检中一个有前景的生物标志物。对cfDNA甲基化状态进行可靠且可量化的分析对其应用至关重要。然而，目前仍存在一些挑战，并且测量方法尚未达成共识。为了解决这些问题，我们开发了两种候选的甲基化cfDNA参考物质（RMs）。

方法

美国国家标准与技术研究院（NIST）的参考物质由五个组分组成，这些组分是通过将体外甲基化的cfDNA模拟物以0%、5%、25%、50%和100%的比例与来自GM24385细胞系的天然状态cfDNA模拟物混合制备而成的。LGC临床诊断公司（LGC）的参考物质包含两个组分：一种来自GM24385基因组DNA的非甲基化cfDNA模拟物，另一种是通过体外甲基化扩增产物获得的甲基化cfDNA。对这些候选参考物质进行了表征，并通过滴液数字PCR（ddPCR）检测确认了三个目标的甲基化状态。为了测试这些参考物质的实用性，六个实验室参与了实验室间研究，每个实验室都使用了自己开发的检测方法，包括甲基化特异性qPCR、纳米芯片数字PCR（dPCR）、基于基质甲基化DNA免疫沉淀的检测方法以及全基因组亚硫酸盐测序。

结果

实验室间研究结果显示，设计的甲基化百分比与所有参与实验室观察到的值高度相关，且每种方法都具有良好的重复性。然而，由于检测方法的特异性偏差，观察到了略微不同的甲基化比例。

结论

本研究清楚地证明了候选参考物质作为评估检测方法性能的标准的重要性，同时也提高了临床应用中报告cfDNA甲基化状态的可靠性。