一种高效的研究自身免疫疾病中ANA? B细胞的方法，该方法结合了流式细胞术和单细胞分析技术

《Molecular Medicine》：An efficient approach to study ANA? B cells in autoimmune diseases integrating flow cytometry with single-cell analysis

摘要

目的

多种自身免疫性疾病的特点是存在针对核抗原的自身抗体。这些抗体几乎存在于所有系统性红斑狼疮（SLE）患者体内。研究由单个B细胞产生的抗核抗体（ANA）可以为我们提供关于自身抗体结构和功能特性的关键见解。传统的单细胞克隆和测序技术或单细胞（Nojima）培养方法存在显著局限性。为了克服这些局限性，我们开发了一个集成平台，该平台将流式细胞术检测ANA反应性B细胞与优化的单B细胞培养系统相结合。

方法

我们使用生物素标记的核提取物和荧光标记的链霉亲和素进行流式细胞术检测，以识别ANA反应性B细胞，随后在表达CD40L和BAFF、IL-2及IL-21的饲养细胞存在下对细胞进行分选和培养。这种集成方法旨在提高克隆分辨率，并比传统的单细胞克隆方法更有效地回收ANA特异性B细胞。

结果

我们从健康捐赠者和SLE患者体内分离并扩增了不同B细胞亚群（幼稚型、CD27+ IgM+ 和 IgG记忆型）的ANA+ 和 ANA- B细胞。这些细胞在标准条件下培养了26天后，82%的幼稚型B细胞、53%的CD27+ IgM+ B细胞以及64%的IgG+ 记忆型B细胞产生了超过1.0微克的免疫球蛋白。我们进一步证明，88-95%的ANA+ B细胞通过HEp-2染色显示出了ANA反应性。

结论

该方法建立了一个用于分离和扩增ANA B细胞的稳健平台，有助于生产单克隆自身抗体并分析B细胞受体（BCR）基因序列。通过将单个ANA+ B细胞与表达CD40L的饲养细胞及关键细胞因子（BAFF、IL-2和IL-21）共同培养，实现了细胞的扩增，这些因子共同促进了它们的存活、增殖以及向分泌抗体的细胞分化。这种方法通过能够在B细胞分化的不同阶段识别特定的自身抗原靶点，为理解自身免疫性疾病中ANA反应性IgG的病因提供了重要的新途径。