转录组与蛋白质组联合分析揭示猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）感染诱导自噬依赖性铁死亡以促进病毒复制

《Veterinary Research》：Integrated analysis of transcriptome and proteome reveal that PDCoV infection induces autophagy-dependent ferroptosis to facilitate viral replication

猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）是一种新发肠致病性冠状病毒，在全球养猪业中引发仔猪严重腹泻。目前PDCoV与宿主细胞的相互作用机制尚不清晰。研究人员采用转录组学与蛋白质组学联合分析策略，系统解析PDCoV感染后的宿主应答特征。结果显示，感染后1.5小时共鉴定到1448个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），18小时则鉴定到11753个DEGs及898个差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）。转录组与蛋白质组的整合分析显示，先天免疫、自噬及铁死亡信号通路显著富集。蛋白质-蛋白质互作（protein–protein interaction, PPI）网络分析表明，干扰素诱导四肽重复蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1, IFIT1）、黏病毒抗性蛋白2（myxovirus resistance 2, MX2）、干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15, ISG15）、自由基S-腺苷甲硫氨酸结构域蛋白2（radical S-adenosyl methionine domain containing 2, RSAD2）、2′-5′-寡腺苷酸合成酶样蛋白（2′-5′-oligoadenylate synthetase like, OASL）、自噬相关蛋白14（autophagy related 14, ATG14）及谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）是该互作网络的核心分子。研究人员证实PDCoV感染可同时诱导自噬与铁死亡，抑制自噬可显著阻断PDCoV诱导的铁死亡并降低病毒增殖水平。该研究系统描绘了PDCoV感染后的转录组与蛋白质组动态变化，深化了对PDCoV致病机制的理解，为PDCoV感染的防控策略优化提供了重要依据。

本研究针对猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）全球流行、可跨物种传播并对养猪业造成严重经济损失的背景展开。尽管已有研究证实PDCoV可通过拮抗I型干扰素产生、诱导细胞凋亡与自噬促进自身复制，但其感染过程中自噬与铁死亡的调控关系及其对病毒复制的作用尚未明确。研究人员通过开展整合转录组与蛋白质组学分析，结合功能实验验证，首次揭示了PDCoV感染通过诱导自噬依赖性铁死亡促进病毒复制的分子机制，相关成果发表于《Veterinary Research》。

关键技术方法方面，研究人员使用中国山西腹泻猪场分离的PDCoV CHN/SX-Y/2023株，感染猪肾细胞系LLC-PK1构建体外感染模型。分别采集感染后1.5小时与18小时的样本进行转录组测序，18小时样本同步开展串联质谱标签（Tandem Mass Tags, TMT）定量蛋白质组学检测。通过生物信息学整合分析差异表达基因（DEGs）与差异表达蛋白（DEPs）的功能富集、蛋白质互作网络，并利用自噬抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）与Liproxstatin-1（Lip-1）、ATG5基因干扰技术，结合免疫荧光、蛋白质印迹、细胞内亚铁离子、脂质活性氧及丙二醛检测等方法验证表型与机制。

研究结果如下：

转录组分析显示，感染后1.5小时DEGs主要富集于病毒防御反应与线粒体功能，18小时DEGs显著上调先天免疫、炎症应答及细胞周期相关通路，其中干扰素刺激基因（如IFIT1、ISG15、RSAD2、OAS2）及铁死亡相关分子（如GPX1）表达发生显著改变。

整合分析发现，1.5小时与18小时的共同DEGs主要参与抗病毒天然免疫与细胞凋亡调控，蛋白质组学数据进一步证实免疫应答、铁离子结合及自噬相关通路显著富集，PPI网络核心节点包含MX2、CXCL10、ISG15等先天免疫分子及ATG14、GPX4等自噬与铁死亡关键调控因子。

功能实验证实，PDCoV感染可显著提升LLC-PK1细胞中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 Ⅱ, LC3-Ⅱ）表达、降低p62蛋白水平，并促进LC3与溶酶体关联膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1, LAMP1）共定位，同时细胞内脂质活性氧、亚铁离子（Fe²⁺）及丙二醛含量显著升高，明确PDCoV可同时激活自噬与铁死亡。

抑制自噬实验表明，使用CQ处理或敲低ATG5均可显著降低PDCoV感染诱导的脂质活性氧、Fe²⁺及丙二醛水平，证实PDCoV诱导的铁死亡依赖于自噬激活。

病毒复制机制研究显示，抑制自噬或铁死亡均可显著降低PDCoV核衣壳蛋白表达及病毒滴度，且自噬抑制剂在早期感染阶段即可发挥抑制作用，而铁死亡抑制剂的抑制效应随感染进程逐渐增强，证明自噬与铁死亡均为PDCoV有效复制所必需。

讨论部分指出，本研究首次在PDCoV感染体系中证实自噬与铁死亡的调控关联及对病毒复制的协同作用。研究发现的RSAD2、IFIT家族分子及铁稳态相关分子FTL、GCLM等可作为潜在抗病毒靶点。与既往报道中铁死亡激活抑制PDCoV复制的结论存在差异，研究人员认为可能源于细胞模型与病毒毒株的差异。研究提出的“自噬依赖的铁死亡促进PDCoV复制”模型为理解冠状病毒与宿主互作提供了新视角，也为开发靶向宿主自噬-铁死亡轴的抗病毒策略奠定了理论基础。论文最终结论强调，PDCoV感染通过诱导自噬依赖性铁死亡促进自身复制，该机制为PDCoV致病机理研究与防控药物研发提供了新的关键靶点。