牙龈卟啉单胞菌HmuS蛋白的生化与功能表征揭示其参与血红素代谢

《Frontiers in Microbiology》：Biochemical and functional characterization of Porphyromonas gingivalis HmuS protein reveals its participation in heme metabolism

　　

背景：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）缺乏完整的血红素生物合成途径，且不利用铁载体获取铁，其从血红素中萃取铁的确切机制尚不清楚。本研究旨在表征牙龈卟啉单胞菌HmuSPg蛋白，并将其特性与脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）同源蛋白进行比较。 方法：研究人员采用紫外-可见光谱法验证血红素结合并追踪血红素代谢过程；利用高效液相色谱（HPLC）或液相色谱-质谱（LC-MS）测定细菌细胞及沉积色素中的卟啉水平，通过原子吸收光谱或菲啰嗪法检测铁含量；借助RNA测序（RNA-seq）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blotting）及酶活性测定，分析hmuSPg基因缺失对其他基因表达的影响。 结果：尽管HmuSPg含有钴螯合酶特征结构域，因而可归为I类螯合酶家族，但该蛋白表现出独特特征。HmuSPg是由6个结构域组成的大分子蛋白，结构建模预测其具有两个潜在的血红素结合位点。体外实验显示，HmuSPg可结合血红素，且其体外参与血红素代谢的过程受NADH及牙龈卟啉单胞菌内膜组分的刺激。在液体培养基中生长的ΔhmuSPg突变株细菌细胞及沉积于细胞表面的色素中，原卟啉IX（PPIX）含量显著降低，提示该突变株可能丧失了从血红素中释放铁并生成PPIX的能力。hmuSPg基因失活会降低生物膜形成能力，并诱导参与血红素摄取与稳态的基因表达发生改变。 结论：在特定体内环境下，当血红素仍可获取、宿主蛋白高效螯合铁且细胞内铁储备耗竭时，HmuSPg可能参与血红素代谢过程。

这篇发表于《Frontiers in Microbiology》的研究聚焦牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）——一种革兰阴性厌氧菌，也是牙周炎发生发展的核心病原体——的铁获取机制。该菌属于拟杆菌门（Bacteroidota），是血红素营养缺陷型，缺乏完整的血红素生物合成途径，也不产生或利用铁载体，因此必须依赖宿主来源的血红素作为铁的主要来源。然而，目前学界尚未明确该菌从血红素中萃取铁的具体分子机制。既往研究发现，拟杆菌门成员普遍携带Hmu系统，其中HmuS蛋白与钴螯合酶（CobN）同源，但在牙龈卟啉单胞菌中的功能尚未被系统解析。鉴于血红素代谢与细菌毒力密切相关，阐明HmuS^Pg的功能，不仅能填补该菌铁获取机制的研究空白，也可为靶向阻断病原体营养供给的防治理念提供新依据。

研究人员为开展研究采用了多维度技术体系：以牙龈卟啉单胞菌野生型W83株为对照，构建hmuS^Pg基因缺失突变株、回补株及对照过表达株；通过紫外-可见光谱分析蛋白与血红素的相互作用及代谢动力学；采用高效液相色谱与液相色谱-质谱定量细菌胞内及胞外色素中的血红素与原卟啉IX（PPIX）；利用RNA测序与实时荧光定量PCR解析基因表达谱变化；结合蛋白质免疫印迹、酶活性分析及生物膜形成实验评估表型差异；并通过AlphaFold结构建模与系统发育分析预测蛋白结构与进化关系。

研究结果分为四个核心部分。第一部分“HmuS^Pg属于螯合酶家族”显示，HmuS^Pg由约1450个氨基酸残基组成，分子量约165 kDa，与脆弱拟杆菌HmuS^Bf氨基酸序列一致性达47.35%，与钴螯合酶及镁螯合酶（ChlH）同属螯合酶家族，但形成独立的进化分支；结构预测显示其包含6个结构域，其中结构域IV富含甲硫氨酸且形成表面暴露环，与经典螯合酶存在显著差异。第二部分“HmuS^Pg可能定位于周质空间”指出，该蛋白N端含信号肽，N端与C端均含跨膜α螺旋，为膜锚定蛋白；在大肠杆菌模型中，重组HmuS^Pg主要定位于内膜，C端暴露于周质侧，提示其在天然宿主中可能同样定位于周质空间。第三部分“HmuS^Pg是参与血红素代谢的血红素结合蛋白”证实，纯化的带组氨酸-麦芽糖结合蛋白（His-MBP）标签的HmuS^Pg可与血红素特异性结合，氧化态下Soret峰位于409 nm，还原态下红移至427 nm，且结合模式与HmuS^Bf一致；体外代谢实验显示，在NADH与牙龈卟啉单胞菌内膜组分共同作用下，HmuS^Pg可催化血红素降解，表现为Soret峰（424 nm）与Q带（528 nm、559 nm）吸光度随时间下降；在ΔhmuS^Pg突变株中，胞内及胞外色素的PPIX含量均显著低于野生型，提示该蛋白参与铁从血红素中释放的过程。第四部分“hmuS^Pg基因失活诱导铁/血红素转运系统与细菌毒力潜能的转录重塑”表明，hmuS^Pg基因在铁与血红素匮乏条件下表达上调；突变株虽生长速率、总铁含量与血红素吸附能力无显著变化，但RNA测序显示80个基因表达发生改变，其中hmu操纵子其余基因表达上调，而TonB依赖性受体、阳离子外排系统及fimA/fimB（长菌毛组分）基因表达下调；表型层面，突变株生物膜形成能力降低，赖氨酸特异性牙龈蛋白酶（Kgp）活性下降，精氨酸特异性牙龈蛋白酶（Rgp）活性升高，同时参与铁获取的IhtB蛋白表达减少。

讨论部分进一步阐释了结果的生物学意义：拟杆菌门成员不依赖铁载体，牙龈卟啉单胞菌仅能通过血红素获取铁，HmuS^Pg作为Hmu系统的组分，可能在周质空间中通过两步机制参与血红素降解——位点I（Met75与His252）结合血红素，位点II（His544与His1217）催化铁释放，生成的PPIX可分泌至胞外形成色素，铁则通过FeoB转运体进入胞质；该蛋白在实验室培养条件下并非必需，可能因其他铁获取通路（如Iht系统）的代偿作用，但在体内低铁微环境中可能发挥关键作用；突变株的毒力相关表型改变，如生物膜形成能力下降、牙龈蛋白酶活性失衡，均与铁稳态紊乱直接相关。研究最终得出结论：HmuS^Pg可在体外结合血红素并表现出依赖NADH与内膜组分的代谢活性，体内参与血红素铁释放与PPIX生成，可能作为血红素处理复合物的组分，在特定体内铁需求状态下参与牙龈卟啉单胞菌的血红素代谢，这一发现揭示了拟杆菌门中一类新型的血红素利用机制。