无痕环状RNA合成用于表达长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂治疗2型糖尿病

《Journal of Advanced Research》：Synthesis of scarless circular RNAs expressing long-acting GLP-1RAs for type 2 diabetes therapy

　　

研究人员开发了一种新型无痕PIE（Scarless PIE，SLPIE）系统，通过将核心外显子序列嵌入分裂型内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site，IRES），显著降低了环状RNA（circRNA）的免疫原性。利用该平台合成的编码胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like Peptide-1，GLP-1）或其衍生物GLP-1_FcBO（融合IgG-Fc亲和肽）的无痕circRNA，经脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles，LNP）包裹后，在糖尿病小鼠模型中展现出与司美格鲁肽（Semaglutide）相当的强效且持久的降糖及减重效果，疗效持续7天。研究进一步建立了基于RNase III缺陷型大肠杆菌（E. coli）的可扩展生产工艺，并通过引入5–7%的N6-甲基腺苷（m6A）修饰提升了翻译效率并维持低免疫原性。该SLPIE系统为下一代circRNA疗法提供了简便、灵活且可规模化的技术路径，为糖尿病和肥胖症的治疗开辟了新方向。

研究背景与意义

全球2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）患者数量持续增长，预计到2045年将达7.83亿，成为重大公共卫生挑战。天然GLP-1因半衰期短受限，现有长效类似物如司美格鲁肽虽已上市，但仍依赖反复注射。线性mRNA疗法存在稳定性差、易降解等问题，而环状RNA（circRNA）凭借其抗外切酶降解的特性，具备更长的体内半衰期，成为极具潜力的核酸药物形式。然而，传统circRNA合成方法（如PIE系统）会残留外显子“疤痕”（scar）序列，形成双链RNA结构并激活蛋白激酶R（Protein Kinase R，PKR）介导的先天免疫反应，限制了临床应用。此外，circRNA的规模化生产与高效翻译优化仍是亟待解决的关键问题。为此，研究人员开发了无痕PIE（SLPIE）系统，旨在实现安全、长效、可规模化生产的circRNA编码GLP-1受体激动剂（GLP-1 Receptor Agonist，GLP-1RA）用于治疗T2DM。该研究成果发表于《Journal of Advanced Research》。

关键技术方法

研究人员首先设计了SLPIE系统，将T4噬菌体胸苷酸合成酶基因内含子的核心外显子序列E1/E2嵌入分裂型肠道病毒B107 IRES（EV-B107_IRES）中，消除疤痕序列。通过体外转录（In Vitro Transcription，IVT）结合GTP/Mg²⁺诱导自剪接实现circRNA环化，并利用N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰优化翻译效率与免疫原性。采用脂质纳米颗粒（LNP）包裹circRNA，比较二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）与二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）作为辅助脂质的递送效果。在细胞水平验证circRNA的环化效率、翻译活性及免疫原性；在饮食诱导联合低剂量链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）建立的T2DM小鼠模型中评估单次给药后的降糖、减重疗效。最后，利用RNase III缺陷型大肠杆菌HT115（DE3）菌株实现circRNA的原核规模化合成。

研究结果

Synthetic strategy of scarless CircRNA using PIE system

研究人员将核心E1/E2序列嵌入CVB3_IRES的两个位点，构建SLPIEv1与SLPIEv2版本。纳米孔测序证实环化位点精确，尿素琼脂糖凝胶电泳显示SLPIEv2环化效率达74.03%，接近传统PIE系统的78.85%。转染HEK293T细胞后，SLPIEv2-circEGFP表达水平与传统PIE相当，证明其兼具高效环化能力与完整翻译功能。

Optimization of IRESes and regulatory elements for scarless CircRNA translation

筛选CVB3、EV-B107与HRV-B3三种病毒IRES，发现EV-B107_IRES在SLPIEv2构型中翻译效率最高。进一步优化调控元件，确定在开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）终止密码子后插入6×polyAC可获得最强翻译活性，确立了“分裂EV-B107_IRES-ORF-6×polyAC”的核心骨架。

Optimization of nucleotide modifications for enhanced CircRNA performance

对比m¹Ψ与m⁶A修饰的影响，发现5% m⁶A可显著提升circRNA翻译效率且不干扰环化，而m¹Ψ严重抑制环化。m⁶A修饰窗口控制在5–7%时效果最佳，超过10%则产生抑制作用。免疫原性检测显示，5% m⁶A修饰的SLPIEv2 circRNA显著降低RIG-I、IFNβ、IL-6及TNFα的表达，实现低免疫激活。

In vivo delivery of SLPIEv2-generated CircRNA using lipid nanoparticles

采用微流控技术制备LNP，DOPE配方较DSPC配方表现出更高的蛋白表达量与更优的稳定性。体内成像显示，LNP包裹的circFLuc在小鼠体内表达可持续144小时，远超线性mRNA的72小时。血清与组织免疫因子检测证实该制剂安全性良好。

Therapeutic efficacy of CircGLP-1RA RNAs in diabetes management

设计抗DPP-4降解的GLP-1突变体，融合人胰岛素信号肽与IgG-Fc亲和肽（FcBO）以延长半衰期。在T2DM小鼠模型中，单次注射LNP-circGLP-1_FcBO可实现长达7天的显著降糖与减重效果，疗效优于或与司美格鲁肽相当。

Scalability of CircRNAs production by SLPIEv2 in E. Coli

在RNase III缺陷型HT115（DE3）菌株中实现circRNA的原核合成，优化条件为37°C诱导与100 mM Mg²⁺浓度。每10 mL菌液可纯化获得约3.03 μg circGLP-1，且转染细胞后仍保留受体激活功能，证明具备工业化生产潜力。

讨论与结论

研究人员指出，SLPIE系统通过将疤痕序列隐藏于IRES内部，避免了Clean-PIE需针对每个基因重新设计的局限，兼具通用性与灵活性。5–7% m⁶A修饰在保障环化效率的同时有效规避先天免疫识别。DOPE-LNPs因其肝脏趋向性成为糖尿病治疗的理想递送载体。尽管单次给药可实现近一周疗效，仍需进一步延长作用时间并推进大规模生产工艺。此外，需完善长期安全性评价与标准化质控体系。

结论：本研究利用SLPIE系统成功构建了高效、低免疫原性的长效GLP-1RA编码circRNA，经DOPE-LNP递送后在T2DM小鼠中展现出与司美格鲁肽相当的降糖与减重效果，为circRNA疗法在代谢性疾病中的应用提供了重要范式。