《Journal of Biological Chemistry》：Creatine metabolism regulates trophectoderm formation in early mouse embryos via an energy-cytoskeleton-YAP axis
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肌酸代谢在体细胞中已被证实参与能量稳态调控，但其在哺乳动物早期胚胎发育中的功能及机制尚不清楚。研究发现，肌酸代谢对小鼠胚胎从8细胞期至囊胚期的发育至关重要。抑制肌酸代谢会导致胚胎在桑椹胚向囊胚转化的阶段发生特异性阻滞，显著削弱囊胚中滋养外胚层(trophect
肌酸代谢在体细胞中已被证实参与能量稳态调控，但其在哺乳动物早期胚胎发育中的功能及机制尚不清楚。研究发现，肌酸代谢对小鼠胚胎从8细胞期至囊胚期的发育至关重要。抑制肌酸代谢会导致胚胎在桑椹胚向囊胚转化的阶段发生特异性阻滞，显著削弱囊胚中滋养外胚层(trophectoderm, TE)的形成，而对内细胞团(inner cell mass, ICM)无显著影响。机制研究表明，肌酸代谢受阻会降低ATP水平，不仅扰乱肌动蛋白相关蛋白2(actin-related protein 2, ARP2)的分布并抑制其介导的F-肌动蛋白(F-actin)组装，还会激活AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)。这些效应共同阻碍Hippo信号通路效应因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)的核定位。YAP核转位受损导致TE形成、细胞骨架及肌酸代谢相关基因的表达下调。外源性补充肌酸、YAP激动剂或AMPK抑制剂可部分逆转上述异常。本研究揭示，肌酸代谢通过“能量缓冲–F-肌动蛋白组装–YAP激活”这一核心轴调控早期胚胎发育中的TE形成，为哺乳动物植入前发育的代谢调控提供了新的认识。
哺乳动物早期胚胎发育始于受精卵，经历卵裂、致密化、极化和囊胚形成等关键事件。囊胚阶段的首次谱系分化产生内细胞团(ICM)和滋养外胚层(TE)，其中TE是胎盘的前体，对胚胎植入及妊娠维持至关重要。已知Hippo信号通路及其效应因子YAP在TE分化中发挥核心作用，同时囊胚发育伴随糖酵解增强的代谢转变。然而，早期胚胎如何感知并整合能量状态以精确调控细胞命运，其上游代谢枢纽及具体分子机制仍不明确。已有研究表明代谢物不仅是能量和生物合成的底物，还可直接调控基因表达，但能否存在一个中心“代谢开关”将能量代谢、细胞骨架动态与转录调控联系起来尚未被探索。肌酸通过肌酸/磷酸肌酸系统在细胞内维持ATP/ADP比率，为高能需求过程提供即时能量缓冲，但在早期胚胎发育中的作用仍缺乏直接证据。前期绵羊胚胎超敏代谢组学数据显示肌酸丰度在卵母细胞成熟阶段上升，而在8细胞至囊胚阶段下降，提示其可能在早期胚胎发育中被利用。基于此，研究人员提出科学假设：肌酸代谢在8细胞至囊胚阶段被激活，通过调控细胞能量状态影响下游细胞骨架动态及Hippo等信号通路，从而精准调控谱系分化和囊胚形成。
研究人员采用昆明小鼠为模型，结合体内外实验，通过功能缺失与挽救实验、转录组与翻译组测序(transcriptome and translatome sequencing, T&T-seq)、分子细胞生物学等方法开展研究。关键技术包括：小鼠超排卵与体外受精(in vitro fertilization, IVF)、胚胎体外培养(in vitro culture, IVC)、药物干预（肌酸代谢抑制剂环肌酸cyclocreatine, CCr；AMPK抑制剂dorsomorphin；YAP激动剂GA-017；糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖；ARP2/3复合物抑制剂CK666）、免疫荧光染色、蛋白质印迹(Western blot)、ATP检测、实时定量PCR(qRT-PCR)以及Co-IP联合质谱(Co-IP-MS)筛选互作蛋白。
研究结果
肌酸代谢对小鼠8细胞至囊胚期发育至关重要
在受精卵至囊胚全程培养中添加CCr不影响卵裂率及8细胞、桑椹胚形成率，但呈剂量依赖性地抑制囊胚形成，并在体内模型中同样显著降低囊胚率，导致约半数胚胎阻滞于桑椹胚阶段。阶段性干预表明，肌酸代谢的功能窗口集中在8细胞至囊胚转化期，但调控作用自8细胞期开始累积。
肌酸代谢特异性调控TE形成
外源补充肌酸可完全逆转CCr引起的囊胚率下降。免疫荧光显示，CCr处理组囊胚总细胞数与TE细胞数显著减少，而ICM细胞数无明显变化；TE标志基因Cdx2、Elf5、Gata3及增殖基因Pcna表达下调，ICM标志基因Sox2不变，证明肌酸代谢特异性促进TE形成。
肌酸代谢通过调控YAP核定位促进TE形成
转录组与翻译组测序显示，CCr处理在囊胚阶段引起大量基因差异表达，KEGG富集提示下调基因涉及肌动蛋白细胞骨架调控、紧密连接、黏附连接及Hippo信号通路。实验证实抑制肌酸代谢降低F-肌动蛋白聚合程度及β-肌动蛋白水平，但不影响微管网络；同时YAP核定位细胞数减少，活性YAP比例下降。补充YAP激动剂GA-017可部分恢复囊胚率、TE细胞数及F-肌动蛋白组装，表明肌酸代谢通过YAP核转位调控TE形成。
抑制肌酸代谢可能通过激活AMPK阻碍YAP核定位并导致囊胚糖酵解异常
CCr处理显著提高囊胚中磷酸化AMPK(p-AMPK)水平，抑制新生蛋白质合成。加入AMPK抑制剂dorsomorphin可部分恢复囊胚率、YAP核定位及F-肌动蛋白组装。此外，抑制肌酸代谢降低Myc及多个糖酵解关键基因的表达，ATP含量减少，提示能量应激通过AMPK激活与糖酵解抑制共同导致发育异常。
抑制肌酸代谢降低ATP水平，损害F-肌动蛋白组装进而阻碍YAP核定位
在桑椹胚阶段已观察到F-肌动蛋白荧光强度下降及YAP核定位减少，但此时β-肌动蛋白水平与p-AMPK/AMPK比率未显著改变，提示ATP不足首先影响细胞骨架组装。使用糖酵解抑制剂2-DG降低ATP同样削弱F-肌动蛋白组装，验证能量供应不足是直接原因。
肌酸激酶B(creatine kinase B, CKB)可能通过与ARP2相互作用并利用肌酸-磷酸肌酸系统供能来促进F-肌动蛋白组装
Co-IP-MS鉴定到CKB与ARP2等细胞骨架蛋白相互作用。抑制肌酸代谢虽不改变Arp2转录与翻译水平，却导致ARP2分布异常，细胞边界模糊。ARP2/3复合物抑制剂CK666在200 μM浓度下模拟CCr表型，包括囊胚形成受阻、F-肌动蛋白异常、YAP核定位减少及TE细胞数下降。
讨论与结论
本研究首次系统阐明肌酸代谢通过“能量缓冲–F-肌动蛋白组装–YAP激活”轴调控小鼠早期胚胎TE形成。肌酸代谢在8细胞期后维持局部ATP稳态，确保ARP2介导的F-肌动蛋白正确组装，从而解除对Hippo通路的抑制并促进YAP核转位。活化的YAP-TEAD复合物驱动包含细胞骨架基因、肌酸代谢酶及TE命运决定因子的转录程序，精准调控TE形成。该轴将代谢物、细胞骨架动态与核心发育信号通路整合在一起，填补了早期胚胎代谢调控领域的空白，为理解代谢与环境互作影响生殖健康提供了新框架。研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。
