S100A9通过调控线粒体-内质网（ER）互作介导的内皮细胞炎症损伤促进肺动脉高压（PAH）

《Interdisciplinary Medicine》：S100A9 promotes pulmonary arterial hypertension by regulating mitochondria–endoplasmic reticulum interaction-mediated inflammatory injury of endothelial cells

　　

肺动脉高压（PAH）是一种以肺血管收缩和血管重塑为特征的进展性疾病。本研究旨在阐明巨噬细胞来源的S100钙结合蛋白A9（S100A9）在PAH发病过程中，通过线粒体-内质网（ER）互作介导的肺动脉内皮细胞（ECs）炎症反应中的作用。体内外研究结果一致表明，巨噬细胞来源的S100A9显著加剧了EC损伤。S100a9基因缺失或S100A9抑制剂均能显著限制PAH小鼠的病理进展。S100A9激活ECs中的Toll样受体4（TLR4）/p38丝裂原活化蛋白激酶（TLR4/p38）通路，导致信号转导衔接蛋白2（STAP2）上调，后者随后与富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）相互作用以增强ER-线粒体接触，从而激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体信号级联。靶向STAP2或抑制线粒体-ER接触可有效减轻S100A9诱导的EC损伤和PAH进展。本研究证明，巨噬细胞来源的S100A9通过TLR4/STAP2介导的线粒体-ER互作促进肺动脉EC损伤，从而加剧PAH进展。针对S100A9的基因或分子干预在改善PAH方面展现出良好的治疗潜力。

研究背景与意义

肺动脉高压（PAH）是一种慢性进展性疾病，以肺血管收缩和血管重塑为主要特征，常进展为右心衰竭（HF）并导致不良临床结局。目前PAH的临床治疗主要集中于内皮素受体拮抗剂及前列腺素衍生物等扩血管途径，虽能缓解症状和改善血流动力学，但无法完全逆转血管重塑。PAH复杂的病理机制涉及多种因素，其中血管内皮细胞（ECs）作为感受血流动力学变化和缩血管刺激的首要传感器，其功能障碍被认为是血管重塑相关疾病的关键起始步骤。近年研究发现，免疫与炎症反应在PAH发病中与疾病进展密切相关，免疫细胞（如巨噬细胞）释放的大量炎症介质可促进ECs功能障碍，进而驱动血管重塑与心衰。在PAH进展的肺组织中，研究人员观察到S100钙结合蛋白A9（S100A9）高表达的单核-巨噬细胞显著浸润。S100A9主要由巨噬细胞和中性粒细胞释放的内源性损伤相关分子模式（DAMP），是一种强效炎症介质。然而，巨噬细胞来源的S100A9调节ECs功能的具体分子靶点尚不清楚，特别是S100A9是否及如何调控ECs中的线粒体-内质网（ER）互作及其潜在分子机制仍有待阐明。此外，信号转导衔接蛋白2（STAP2）在PAH相关内皮损伤中的作用亦未见报道。因此，开展此项研究对于全面理解PAH血管重塑过程中的免疫代谢调控具有重要意义。该论文发表在《Interdisciplinary Medicine》。

主要关键技术方法

研究人员采用了PAH合并射存射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）小鼠模型（高脂饮食联合L-NAME诱导）及缺氧诱导的PAH小鼠模型；使用了S100a9基因敲除（S100a9^?/?）小鼠、巨噬细胞清除（氯膦酸盐脂质体）、中性粒细胞清除（抗Ly6G抗体）及S100A9药理抑制剂（Tasquinimod）；构建了内皮细胞特异性过表达Stap2或Fate1的腺相关病毒（AAV）并进行尾静脉注射；开展了人肺动脉内皮细胞（HPAECs）与外周血单核细胞共培养及重组人S100A9蛋白（rS100A9）刺激实验；运用了RNA测序（RNA-seq）、高分辨率结构化照明显微镜（HIS-SIM）、透射电镜（TEM）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、线粒体-ER荧光共定位分析、Seahorse能量代谢分析、线粒体活性氧（ROS）检测、线粒体膜电位（MMP）检测、蛋白质印迹（Western blot）及临床PAH患者肺组织标本分析等技术手段。

研究结果

2.1 巨噬细胞通过分泌S100A9促进肺内皮细胞损伤

在PAH合并HFpEF小鼠模型中，肺血管壁厚度和肌化逐渐增加，肺组织中S100A9水平呈持续上升趋势，且主要与巨噬细胞标志物F4/80表达一致，中性粒细胞标志物无显著变化；清除中性粒细胞不影响肺S100A9水平及心功能，而清除巨噬细胞则显著降低肺S100A9与F4/80水平，并减轻肺动脉肌化、血管壁增厚、心肌肥厚及纤维化，改善体重、肺湿/干重比、心重/胫骨长度比及超声心动图参数。人PAH受试者外周血单核细胞与HPAECs共培养发现，S100A9过表达单核细胞显著降低HPAECs一氧化氮（NO）产生并促进IL-1β分泌，rS100A9单独刺激亦有类似效应，可被S100A9中和抗体逆转。这表明巨噬细胞通过释放S：100A9介导HPAECs炎症损伤，促进PAH进展。

2.2 S100A9通过TLR4/P38通路上调STAP2增强内皮细胞炎症小体形成

S100a9^?/?小鼠基线无显著差异，PAH诱导后WT小鼠出现明显病理改变，而S100a9^?/?小鼠这些改变显著减轻。RNA-seq显示rS100A9刺激HPAECs后STAP2显著上调，并富集线粒体相关ER膜（MAM）及炎症相关通路；Western blot证实rS100A9增加STAP2及NLRP3炎症小体信号，PAH小鼠肺组织亦上调，S100a9^?/?可减弱。TLR4（而非RAGE）抑制或敲低可抑制STAP2表达；下游通路中仅p38抑制剂（非p65、JNK、ERK抑制剂）可抑制STAP2与NLRP3信号；体内Tasquinimod处理可改善PAH病理并下调STAP2/NLRP3级联；缺氧PAH模型中S100a9缺陷同样减轻血管壁增厚及TLR4/p38-NLRP3信号。因此S100A9通过TLR4/p38级联促进ECs中STAP2/NLRP3炎症信号。

2.3 STAP2与LRRK2相互作用增强线粒体-ER接触

rS100A9刺激增加HPAECs线粒体-ER共定位（HIS-SIM）并缩短线粒体与ER距离（TEM），Stap2敲低则增加距离；rS100A9上调磷酸化LRRK2（p-LRRK2）、GRP78、CHOP；分子对接与Co-IP、GST pull-down证实p-LRRK2与STAP2结合（LRRK2的LRR结构域直接结合STAP2），rS100A9增强该结合；MAM组分中p-LRRK2增加，Mli-2（LRRK2抑制剂）可减少p-LRRK2并抑制NLRP3信号；Stap2敲低可逆转rS100A9引起的ER应激、NLRP3信号、氧化磷酸化（OXPHOS）复合物I/II/IV减少、氧消耗率（OCR）降低、线粒体ROS增加及MMP下降。因此S100A9促进STAP2与p-LRRK2互作，增强线粒体-ER接触并激活NLRP3炎症信号。

2.4 Stap2过表达促进小鼠PAH进展

PAH小鼠肺组织中LRRK2、ER应激标记上调且OXPHOS I/II/IV减少，S100a9^?/?可逆转；内皮特异性Stap2过表达AAV（Stap2^OE-AAV）注射后，PAH小鼠血管肌化、壁厚、心肌肥厚、纤维化加重，心功能受损，体重增加，肺W/D比及HW/TL比增加，肺p-LRRK2、ER应激、NLRP3信号上调，OXPHOS I/II/IV减少；而在S100a9^?/?PAH小鼠中，Stap2^OE-AAV虽仍有一定效应，但较WT PAH小鼠减轻。这证实内皮特异性Stap2过表达显著促进PAH进展。

2.5 下调线粒体-ER接触显著抑制S100A9诱导的内皮细胞损伤

Fate1（可介导线粒体与ER解离）过表达减弱rS100A9增加的线粒体-ER共定位，增加线粒体-ER距离，并减轻rS100A9引起的ER应激标记与NLRP3信号上调、OXPHOS I/II/IV损伤、OCR降低、线粒体ROS增加及MMP下降；敲低MFN2或ITPR3（线粒体-ER接触关键栓系蛋白）亦可减弱S100A9诱导的NLRP3信号。因此破坏线粒体-ER互作可明显改善rS100A9诱导的HPAECs损伤。

2.6 内皮细胞特异性Fate1过表达减轻小鼠PAH进展

内皮特异性Fate1过表达AAV（Fate1^OE-AAV）注射PAH小鼠后，与对照AAV相比，体重、肺动脉肌化、血管壁厚度、心肌细胞表面积、肺W/D比、HW/TL比降低，心功能改善；肺组织ER应激与NLRP3信号下调，OXPHOS I/II/IV增加；S100a9缺陷亦可降低上述信号并增加OXPHOS。这证明在内皮细胞中破坏线粒体-ER互作可有效缓解小鼠PAH进展。

2.7 S100A9在PAH患者疾病进展中起关键作用

PAH患者肺组织S100A9表达显著高于对照组，免疫荧光显示S100A9⁺巨噬细胞增多；PAH患者肺组织STAP2、ER应激蛋白及NLRP3炎症小体相关信号蛋白表达更高；PAH患者肺ECs中STAP2上调且DNA损伤（γ-H2AX）增加。这支持PAH中S100A9升高与STAP2/NLRP3炎症信号激活相关。

讨论与结论总结

讨论部分指出，PAH是一种严重循环疾病，病理涉及ECs损伤与炎症激活，ECs作为血管腔与血液界面在功能障碍后启动血管重塑。本研究首次表明巨噬细胞来源S100A9通过积累线粒体ROS并激活ECs中NLRP3炎症小体，加剧肺内皮屏障破坏；机制上S100A9通过激活TLR4/p38信号轴上调STAP2，促进STAP2与p-LRRK2相互作用，增强线粒体-ER接触，触发NLRP3炎症小体与ER应激信号同时激活，最终导致EC死亡与PAH表型恶化。临床样本分析确认PAH患者肺组织中S100A9、STAP2及下游炎症小体信号蛋白显著升高，凸显该通路临床相关性。研究表明巨噬细胞通过分泌S100A9破坏内皮氧化还原稳态促进PAH向心衰进展；在不同PAH模型中S100A9细胞来源可能不同（本模型以巨噬细胞为主，缺氧模型以中性粒细胞为主），但S100A9均发挥关键调控作用。S100A9通过TLR4/p38级联特异上调适配蛋白STAP2，STAP2与p-LRRRK2结合形成功能复合体，加剧异常线粒体-ER接触，引发线粒体氧化应激与ER应激，促进NLRP3炎症小体组装及内皮OXPHOS功能障碍；STAP2是此信号轴关键效应物，其过表达可消除S100a9缺陷的保护作用并独立加重病情。Fate1过表达选择性破坏线粒体-ER接触，可减少S100A9诱导的线粒体ROS累积与炎症损伤，并减轻小鼠PAH进展，提示靶向线粒体-ER接触位点具有治疗潜力。研究也存在局限：需更大规模随机对照试验验证S100A9抑制剂临床疗效；细胞器动态变化及EC功能可能受其他细胞器互作调控，需进一步研究。

研究结论：巨噬细胞来源的S100A9通过促进STAP2-LRRK2复合体形成，增强线粒体-ER互作，进而触发ECs炎症损伤，驱动PAH进展；靶向S100A9或调控线粒体-ER接触位点可为PAH提供新的治疗策略。