《Journal of Dairy Science》：Dissecting the role of the endoplasmic reticulum in trophectoderm development and blastocyst quality in yak
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牦牛（Bos grunniens）是适应高原极端恶劣环境条件的特有牛种。尽管其在畜牧业中具有重要地位，但有关牦牛繁殖与胚胎发育的认知仍十分有限，尤其是牦牛体外胚胎生产（IVEP）技术尚处于起步阶段。本研究建立了牦牛IVEP培养体系并评估了牦牛胚胎的发育能力。研
牦牛（Bos grunniens）是适应高原极端恶劣环境条件的特有牛种。尽管其在畜牧业中具有重要地位，但有关牦牛繁殖与胚胎发育的认知仍十分有限，尤其是牦牛体外胚胎生产（IVEP）技术尚处于起步阶段。本研究建立了牦牛IVEP培养体系并评估了牦牛胚胎的发育能力。研究人员在牦牛中实现了71.04%的卵裂率和29.18%的囊胚率，与牛的数据相当。然而，牦牛囊胚表现出显著发育异步性，仅35.52%完成完全孵化。免疫染色分析显示，囊胚发育异常由滋养外胚层（TE）发育受损驱动，而非总细胞数减少所致。囊胚扩张与孵化的受阻表现为TE细胞增殖不足及凋亡过度。转录组学分析鉴定出调控囊胚发育的核心模块，包括内质网（ER）应激反应、细胞分泌与黏附以及氨基酸生物合成。值得注意的是，发育迟滞的囊胚相较于正常发育囊胚表现出ER稳态缺陷。IXA4补充实验证实，增强ER功能可显著促进TE发育并有效降低未扩张囊胚比例。综上，本研究阐明了ER功能在调控牦牛TE发育及囊胚质量中的关键作用，不仅填补了牦牛胚胎发育机制研究的空白，也为优化其他处于环境胁迫下家畜的IVEP方案提供了新见解。
该研究针对牦牛繁殖效率低、体外胚胎生产（IVEP）技术滞后且囊胚发育异步性高的产业与科学问题，由中国科学院西北高原生物研究所高原生物适应与进化重点实验室团队开展。研究首先成功构建了牦牛IVEP体系，发现虽然其卵裂率与囊胚率与牛相近，但囊胚扩张与孵化能力严重不足。通过细胞谱系追踪与功能分析，研究人员证实这种缺陷并非源于内细胞团（ICM）总量不足，而是特异性地由滋养外胚层（TE）增殖抑制与凋亡加剧导致。进一步的转录组测序与细胞器超微结构观察揭示了内质网（ER）稳态失衡是制约TE发育的关键分子机制。研究人员通过添加IRE1/XBP1通路激活剂IXA4干预ER功能，验证了增强ER应激反应可显著提升TE质量并促进囊胚孵化。该研究发表于《Journal of Dairy Science》，明确了ER作为评估牦牛囊胚质量与着床潜能的新型标志物，为提高高原家畜IVEP效率提供了理论依据与技术靶点。
为开展上述研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：从屠宰场收集牦牛卵巢构建IVEP模型，依据国际胚胎技术学会标准对囊胚形态进行分级；利用免疫荧光染色技术结合SOX2、SOX17及CDX2谱系标记物，对囊胚内上胚层（EPI）、原始内胚层（PE）及TE的细胞组成进行定量；采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入法与末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法分别检测细胞增殖与凋亡水平；应用Smart-seq2微量RNA测序技术对不同发育等级囊胚进行转录组差异表达基因（DEGs）分析与基因本体论（GO）富集分析；利用ER-Tracker染色与透射电子显微镜（TEM）观测ER形态与超微结构变化；并在胚胎培养体系中添加ER应激通路激活剂IXA4进行功能挽救实验。
Yak Blastocyst Asynchrony Driven by Differential Cell Lineage Development
研究人员通过对牦牛IVEP过程的时序监测，发现虽然早期发育效率与牛、羊相当，但囊胚阶段表现出极端的发育异步性。至第9天，仍有37.90%的囊胚处于未扩张状态，仅35.52%完成孵化。通过谱系特异性标记物的免疫染色定量分析，结果显示未扩张囊胚与已孵化囊胚的总细胞数无显著差异，但细胞比例构成不同：发育良好的囊胚中TE占比显著增加，而发育受阻囊胚中上胚层（EPI）与原始内胚层（PE）的相对比例偏高，表明TE发育滞后导致了整体囊胚发育异步。
Altered TE Proliferation and Apoptosis in Compromised Yak Blastocysts
针对TE的功能状态分析显示，在未扩张囊胚中，TE细胞的增殖活性显著低于已孵化囊胚，而凋亡率则显著升高。相比之下，EPI与PE的细胞凋亡比例在不同发育等级的囊胚间无统计学差异。这一结果明确指出了TE的细胞命运异常——即增殖不足伴随凋亡过度，是导致牦牛囊胚扩张失败与孵化受阻的直接细胞生物学原因。
Gene Expression Changes During Yak Blastocyst Expansion and Hatching
转录组测序分析共鉴定出数百个差异表达基因（DEGs）。尽管多能性基因与谱系分化标记基因的表达在各组间无明显变化，但在TE分化与母体识别相关的基因中富集了大量DEGs。基因本体论（GO）分析揭示，重叠的核心调控通路包括细胞分化、内膜系统功能、ER功能、凋亡过程及细胞通讯，提示这些生物学过程构成了牦牛囊胚围植入期发育的核心调控网络。
Key Functional Modules Regulating Yak Blastocyst Peri-implantation Development
聚类分析将核心DEGs分为三个表达模式簇。其中，在未扩张囊胚中高表达的基因簇与细胞分化抑制及凋亡正相关；而在扩张及孵化囊胚中高表达的基因簇主要涉及ER应激反应（如XBP1、ERP44）及细胞分泌与黏附；仅在孵化囊胚中特异性上调的基因簇则富集于氨基酸生物合成（如ASNS、PHGDH）及胚胎组织发育相关通路。这表明ER功能的激活是囊胚获得进一步发育潜能的前提。
Functional Abnormality of ERs Associated with Blastocyst Developmental Potential
ER-Tracker染色与透射电镜观察证实，发育良好的囊胚中TE区域的ER分布弥散且面积增大，而未扩张囊胚中ER结构紧凑且发育不全。功能实验显示，在培养体系中添加IXA4激活IRE1/XBP1通路后，显著促进了ER在囊胚中的富集。虽然IXA4处理未改变卵裂率与囊胚率，但显著提高了囊胚孵化率，并消除了未扩张囊胚的出现，同时显著降低了TE细胞的凋亡比例，进一步验证了ER功能对TE发育的决定性作用。
在讨论部分，研究人员指出，牦牛IVEP技术的滞后限制了产业发展，而本研究发现的发育异步性主要归因于TE的功能缺陷。鉴于TE是胚胎与母体环境交互的主要界面，其ER稳态的维持对于囊胚扩张及后续的着床至关重要。研究首次将ER确立为评估牦牛囊胚质量的新指标，并通过药理学激活ER应激反应证实了其在改善胚胎质量中的可行性。尽管研究受限于使用牛源优化培养基及IXA4剂量尚未完全优化，但这为后续开发针对高原环境的特异性IVEP方案指明了方向。
CONCLUSIONS
综上所述，本研究证明牦牛IVEP胚胎的发育异步性主要由TE发育受损驱动，并确定ER状态是评估牦牛囊胚质量与着床潜能的新型指标。通过IXA4增强ER功能以提高囊胚质量为优化牦牛IVEP提供了极具前景的策略。本研究阐明了牦牛囊胚发育的分子调控机制，并为鉴定反刍动物胚胎着床潜能的生物标志物提供了新见解。
