《Journal of Dairy Science》：Antimicrobial Efficacy and Food Application Potential of Bacteriocins LL3 and LL4 from Traditional Dairy-Derived Lactococcus lactis
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为应对沙门氏菌（Salmonella）等食源性病原体污染，研究人员采用活性筛选结合宏基因组挖掘策略，从内蒙古乳制品中鉴定并表征新型细菌素。自15株具抑菌活性的分离株中，确定乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）D63与D64携带编码两种细菌素的推定
为应对沙门氏菌（Salmonella）等食源性病原体污染，研究人员采用活性筛选结合宏基因组挖掘策略，从内蒙古乳制品中鉴定并表征新型细菌素。自15株具抑菌活性的分离株中，确定乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）D63与D64携带编码两种细菌素的推定生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster, BGC），分别命名为LL3与LL4。这两种肽均形成两亲性α-螺旋结构，通过破坏细菌细胞膜导致胞内物质泄漏并引发细胞死亡。二者表现出显著的抗菌活性，尤其对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）抑制效果突出。在标准冷藏条件（4°C）下的模拟乳品模型中，合成的LL4可有效控制鼠伤寒沙门氏菌，防腐效能与商业化防腐剂乳酸链球菌素（Nisin）相当。遗传分析显示，该BGC在标准实验室培养条件下基础转录水平极低，且与质粒元件具有高度同源性，提示其为通过水平基因转移获得的移动遗传元件。本研究证实LL3与LL4是具有潜力的天然防腐剂，同时验证了宏基因组挖掘作为高效抗菌基因发现策略的可行性。
研究背景方面，全球食品安全意识持续提升，食源性病原体污染仍是食品工业面临的严峻挑战。行业长期依赖化学合成防腐剂（如亚硝酸盐、苯甲酸钠），但毒理学评估显示其存在致畸、致癌或致敏风险，且细菌耐药性增强促使监管限制趋严。现代消费者对“零添加”、天然来源食品的偏好日益显著，开发兼具高安全性、强抗菌活性与自然来源的生物防腐剂（Biopreservatives）成为食品科学的关键任务。乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）作为公认安全（Generally Recognized as Safe, GRAS）微生物，其产生的细菌素因高效、热稳定、可降解且不易诱导耐药性，被视为化学防腐剂的理想替代物。内蒙古传统发酵乳制品蕴含未被充分开发的LAB资源，结合高通量测序与生物信息学发展的“基因组挖掘”策略，为发现结构新颖、活性独特的新型细菌素提供了有效途径。在此背景下，研究人员假设内蒙古传统发酵乳制品蕴藏可产生新型高稳定性细菌素的LAB资源，旨在挖掘其对食源性病原体的抑制潜力并评估其在食品基质中的应用价值。该研究发表于《Journal of Dairy Science》。
关键技术方法方面，研究人员采集内蒙古传统乳制品样本（奶皮子、奶渣、奶油沉淀物、奶豆腐），分离鉴定LAB菌株并筛选抑菌活性。采用宏基因组测序结合生物信息学工具（如antiSMASH）挖掘抗菌基因簇（BGC），并通过PCR验证目标基因在特定菌株中的分布。利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析基因转录水平。通过固相多肽合成获得目标细菌素LL3与LL4，采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC），结合棋盘法评估联合效应。通过ATP释放、核酸/蛋白质泄漏及碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色流式分析探究膜破坏机制。在模拟乳品模型中评估冷藏与常温条件下细菌素的防腐效力，并以溶血实验评价其安全性。
研究结果方面，传统乳制品源产细菌素LAB的筛选与鉴定：从内蒙古四种代表性乳制品中分离获得59株菌，16S rRNA测序与随机扩增多态性DNA-PCR（RAPD-PCR）分析显示乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）为优势种（32株）。牛津杯法筛选出15株具抑菌活性菌株，其中D64（乳酸乳球菌）对指示病原菌的抑制效果最强。新型细菌素生物合成基因簇（BGC）的基因组挖掘、鉴定与遗传特征：对15株活性菌进行混合宏基因组测序，预测得到一个完整的推定抗菌肽BGC，包含2个核心结构基因（LL3、LL4）及修饰、转运相关基因，具有核糖体合成与翻译后修饰肽（Ribosomally synthesized and Post-translationally modified Peptides, RiPPs）样特征。PCR验证确认该BGC源自D63与D64。RT-qPCR显示LL3与LL4在标准培养条件下基础转录水平极低（仅为看家基因的0.001–0.01倍），表明其受严格调控。LL3/LL4基因簇与质粒pWcMBF8–1的基因组共线性：BLAST比对显示LL3与LL4序列与质粒pWcMBF8–1（GenBank: KR350502.1）片段高度同源（氨基酸一致性>90%），基因排列顺序保守，提示其为可能通过水平基因转移获得的移动遗传元件。合成细菌素LL3与LL4的结构预测、理化性质及抗菌谱：结构预测显示LL3与LL4均形成典型的两亲性α-螺旋，疏水残基与带电荷残基分别聚集于螺旋两侧。MIC测定显示二者具广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌与阴性菌均有抑制效果，其中LL4对革兰氏阴性食源性病原体（如鼠伤寒沙门氏菌）活性更优（MIC 50 μM），且对部分革兰氏阴性菌的抑制效果优于Nisin。棋盘法显示LL3与LL4无协同作用，LL4单体活性占主导。LL3与LL4对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌机制涉及膜破坏：处理组细胞内ATP水平显著降低，核酸与蛋白质泄漏量呈剂量依赖性增加，PI流式结果显示膜通透性显著升高，证实二者通过破坏细胞膜完整性致细菌死亡。溶血活性评估：LL3在200 μM浓度下溶血率<5%，安全性优异；LL4呈浓度依赖性溶血，提示其更适合作为表面消毒剂或非直接摄入的防腐剂材料。LL3与LL4在鼠伤寒沙门氏菌污染的乳品模型中的应用与防腐功效：4°C冷藏条件下，LL4（25 μM）对乳中鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果与Nisin（50 μg/mL）相当（P=0.0001），显著优于对照组；25°C条件下各组抑菌效果差异减小，Nisin略优于LL4，可能与细菌增殖速率超过杀菌速率有关。
讨论与结论部分，研究人员从内蒙古传统乳制品中分离得到两株具广谱抗菌活性的乳酸乳球菌D63与D64，通过基因组挖掘鉴定出一个编码两种新型线性抗菌肽LL3与LL4的BGC。该BGC与质粒pWcMBF8–1具有高度基因组共线性，但LL3与LL4作为独立抗菌单元发挥作用，而非典型的IIb类协同系统。机制研究表明LL4通过破坏细胞膜完整性有效抑制革兰氏阴性病原体。在模拟乳品模型中，LL4于4°C下显示出与商业化防腐剂Nisin相当的抑制功效。综上，LL3/LL4可作为传统防腐剂抗菌谱的补充，为提高冷藏乳制品微生物质量提供了新的活性分子候选。
