藁本内酯通过靶向S100A9抑制中性粒细胞活化并减轻炎症级联反应缓解心肌梗死

《Journal of Ethnopharmacology》：Ligustilide Alleviates Myocardial Infarction by Targeting S100A9 to Inhibit Neutrophil Activation and Attenuate the Inflammatory Cascade

　　

研究人员通过生物信息学分析发现，S100A9是速效救心丸（Suxiao Jiuxin Pills, SJP）缓解心肌梗死（Myocardial Infarction, MI）后早期炎症损伤的关键靶点，其活性成分藁本内酯（Ligustilide, Lig）为该靶点的特异性配体。本研究旨在阐明Lig靶向S100A9抑制中性粒细胞活化从而缓解MI的分子机制。研究人员整合人类MI数据集分析及小鼠MI模型验证锁定S100A9为潜在靶点，采用分子对接、表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）、分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟及细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）筛选SJP中靶向S100A9的成分。在MI模型中，研究人员通过定量实时聚合酶链反应（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western Blot）及酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测梗死心肌及外周血中S100A9的表达；通过超声心动图评估心功能，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride, TTC）染色、血清酶学及组织病理学评估心肌损伤；利用流式细胞术分析心肌中性粒细胞/单核细胞浸润及中性粒细胞S100A9表达；通过Western Blot及qRT-PCR评估中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）形成及NLRP3炎症小体相关分子表达；qRT-PCR检测炎症因子mRNA水平，ELISA检测血清白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）含量；流式细胞术分析骨髓（Bone Marrow, BM）及脾脏免疫细胞浸润及BM细胞亚群比例；qRT-PCR检测BM增殖及分化相关因子mRNA水平。缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）模型进一步验证了Lig的心肌保护作用。结果显示，S100A9是介导SJP心脏保护的关键靶点，Lig为其特异性配体。MI后Lig下调S100A9表达，减轻炎症与凋亡，减小梗死面积并改善心功能；抑制心肌中性粒细胞/单核细胞浸润、NET形成及NLRP3炎症小体活化，降低心肌肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）/IL-1β及血清IL-1β水平；减少BM及脾脏炎性细胞比例，增加BM Lin-及LSK细胞比例，降低巨核红细胞祖细胞比例，下调粒细胞增殖分化相关mRNA水平。I/R模型中Lig亦表现出一致的保护作用。研究人员得出结论，SJP的主要活性成分Lig通过靶向S100A9抑制中性粒细胞活化，减轻MI后急性心肌炎症损伤，发挥心脏保护作用。

研究背景

心血管疾病是全球首要死因，其中缺血性心脏病占比最高。急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction, AMI）因冠状动脉急性闭塞导致心肌缺血坏死，具有高死亡率。AMI后过度的炎症反应会加剧心肌损伤与不良重构，抑制过度炎症是潜在治疗策略。中性粒细胞作为最早招募至缺血区的免疫细胞，其过度活化释放活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）及蛋白酶，并通过形成中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）放大炎症，是AMI后不良预后的关键因素。速效救心丸（Suxiao Jiuxin Pills, SJP）是治疗冠心病心绞痛的经典中成药，临床疗效确切，但其药效物质基础及分子机制尚未完全阐明。S100A9是急性期重要的损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs），在中性粒细胞中高表达，可形成正反馈炎症环路加剧损伤，是潜在的干预靶点。本研究由天津中医药大学团队完成，发表于《Journal of Ethnopharmacology》。

主要技术方法

研究人员整合GEO数据库中GSE141512、GSE48060及GSE60993三个独立的人类心肌梗死外周血转录组数据集，经批次校正后进行差异表达分析及加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA），结合蛋白互作网络筛选核心靶点。通过分子对接、表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）、分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟及细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）筛选并验证SJP活性成分与靶点的结合。采用小鼠左前降支（Left Anterior Descending, LAD）结扎构建永久性心肌梗死模型及缺血45分钟再灌注的心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）模型，设置假手术组、模型组及不同剂量Lig干预组、SJP阳性对照组。综合运用超声心动图、TTC染色、血清生化检测、组织病理学检查评估心功能与损伤；采用qRT-PCR、Western Blot、ELISA、流式细胞术从分子、细胞及组织水平系统解析干预效应及机制。

研究结果

3.1 S100A9被鉴定为MI潜在生物标志物

通过对人类MI数据集的生物信息学整合分析，研究人员筛选出155个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。WGCNA分析识别出27个共表达模块，其中天蓝色、棕色及品红色模块与MI显著相关。取交集获得77个候选基因，富集分析显示其显著参与免疫反应与炎症通路。蛋白互作网络分析最终锁定S100A9、S100A12、TLR4等7个枢纽基因。外部数据集GSE97320验证证实MI患者外周血中S100A9 mRNA表达显著上调，提示其作为MI生物标志物的潜力。

3.2 从SJP中鉴定Lig为S100A9特异性配体

体内实验显示SJP能显著降低MI小鼠血清及梗死心肌组织中S100A9的表达。研究人员对SJP君药川芎的6种主要活性成分进行筛选，分子对接提示藁本内酯（Ligustilide, Lig）、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H等具有结合潜力。SPR定量验证证实Lig与S100A9的结合解离常数（K_D）为5.259×10^-5M，结合亲和力最强且其在川芎挥发油中含量最丰，被选定为关键候选成分。

3.3 Lig直接与S100A9结合的生物物理与细胞学证据

100 ns的分子动力学模拟显示Lig-S100A9复合物结构稳定。细胞热位移分析（CETSA）表明Lig处理提高了原代骨髓中性粒细胞及分化HL-60细胞中S100A9的热稳定性，等温剂量反应指纹CETSA进一步证实该稳定作用呈浓度依赖性，验证了二者的直接结合。

3.4 Lig降低S100A9表达并改善MI诱导的心功能不全

在MI模型中，Lig呈剂量依赖性下调心肌及血清S100A9水平。同时，Lig显著减小梗死面积，降低血清乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）、肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）及肌酸激酶同工酶（Creatine Kinase-MB, CK-MB）水平，减少心肌细胞凋亡。超声心动图显示Lig显著提高左心室射血分数（Left Ventricular Ejection Fraction, LVEF）及左心室短轴缩短率（Left Ventricular Fractional Shortening, LVFS），改善心功能，组织学显示其减轻了心肌结构破坏及炎症浸润。

3.5 Lig减少梗死心肌中性粒细胞与单核细胞浸润，抑制炎症小体表达活化及NETosis

流式细胞术分析显示，Lig减少了梗死心肌中CD45⁺白细胞内中性粒细胞（Ly6G⁺CD11b⁺）及单核细胞（Ly6C⁺CD11b⁺）的比例，并降低了中性粒细胞内的S100A9丰度。机制上，Lig下调心肌组织中NETs相关蛋白髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）、肽酰精氨酸脱亚胺酶4（Peptidyl Arginine Deiminase 4, PAD4）及瓜氨酸化组蛋白H3（Cit-H3）的表达，降低血清游离双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA）水平，抑制NETosis。体外实验证实Lig直接抑制PMA诱导的中性粒细胞ROS生成、NETs形态学改变及dsDNA释放。此外，Lig抑制心肌NLRP3炎症小体通路关键分子NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-Associated Speck-Like Protein, ASC）及活化型Caspase-1的表达，降低心肌TNF-α、IL-1β mRNA及血清IL-1β水平。

3.6 Lig系统性抑制MI后骨髓髓系细胞生成及脾脏储备

鉴于Lig降低了血清IL-1β水平，研究人员探究其对髓系造血的影响。结果显示Lig显著减少了骨髓中CD45⁺白细胞及中性粒细胞的比例，抑制了MI诱导的紧急髓系造血。同时，Lig减少了脾脏中中性粒细胞及单核细胞的蓄积，表明其降低了脾脏的髓系细胞储备库。

3.7 Lig抑制骨髓细胞增殖与分化

流式细胞术分析骨髓造血祖细胞亚群显示，Lig处理增加了Lin^-细胞及LSK（Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺）细胞的比例，减少了巨核红细胞祖细胞（Megakaryocyte-Erythroid Progenitor, MEP）的比例。qRT-PCR结果显示Lig下调了骨髓细胞增殖标志物Ki67、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1, Ccnd1）及髓系分化关键转录因子CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、CCAAT增强子结合蛋白ε（C/EBPε）的mRNA表达，证实其通过抑制增殖与分化程序调控髓系造血。

3.8 Lig通过靶向S100A9介导的免疫反应减轻心肌I/R损伤

在更接近临床再灌注场景的I/R模型中，Lig同样降低了血清S100A9水平，改善了LVEF及LVFS，降低了血清心肌损伤标志物水平。Lig减少了心肌中中性粒细胞与单核细胞浸润，下调了NETs标志物H3cit及炎症小体效应蛋白Cleaved Caspase-1的表达，证实其保护作用在两种损伤模型中具有一致性。

讨论与结论

研究人员在讨论中指出，本研究首次揭示了SJP的核心成分Lig通过靶向S100A9发挥心脏保护作用的具体机制：Lig结合S100A9后，抑制ROS生成及NETosis，减少S100A9释放，打破炎症正反馈；进而抑制NLRP3炎症小体活化及IL-1β分泌，阻断IL-1β驱动的骨髓髓系偏向性造血，从源头减少炎性细胞生成与动员，最终减轻心肌炎症损伤并改善心功能。相较于单一靶点策略，源自中药复方SJP的Lig展现了针对“局部炎症-系统造血”多环节的调控优势。研究也存在一定局限，如未使用S100A9基因敲除动物进行功能缺失验证，未来需进一步探索多成分协同机制。

结论翻译

本研究通过生物信息学筛选确定S100A9为极具前景的治疗靶点，并揭示传统药物SJP的主要生物活性成分藁本内酯（Lig）是其特异性配体。Lig抑制NET形成，进而减少S100A9释放。这一下游效应抑制了中性粒细胞中NLRP3炎症小体的活化，并减弱了IL-1β的分泌。IL-1β信号的下调抑制了骨髓造血干细胞向髓系细胞分化的倾向，并减少了中性粒细胞向心脏的浸润。这些结果共同表明，Lig治疗通过系统性抑制髓系细胞驱动的炎症反应，显著减轻了心肌梗死及缺血再灌注损伤。