DAPL1缺陷通过损害视网膜色素上皮自噬驱动年龄依赖性视网膜病变

《Journal of the Formosan Medical Association》：DAPL1 deficiency impairs autophagy in retinal pigment epithelium to drive age-dependent retinal pathologies

　　

摘要 年龄相关性视网膜病变，尤其是年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD），是全球老年人群不可逆盲的主要原因，其确切机制尚未完全阐明。尽管临床及基础研究已证实视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞自噬缺陷与AMD密切相关，但其调控通路仍不明确。本研究旨在探讨DAPL1在年龄依赖性视网膜病变中RPE细胞自噬缺陷的功能作用及分子机制。研究人员选用18月龄野生型（wild-type, WT）及Dapl1?/?小鼠，采用眼底照相与光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）检测形态学异常；免疫荧光检测GFAP、视紫红质/视蛋白、IBA1及LC3，并对RPE铺片行ZO-1染色；油红O染色分析脂质沉积；Western blot及实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）筛选并验证候选基因，并通过慢病毒过表达及RNA干扰进行功能验证。结果显示，18月龄Dapl1?/?小鼠出现年龄相关性视网膜功能障碍及结构异常，包括视网膜应激增强、光感受器及RPE细胞损伤、脂质积聚与小胶质细胞活化。Dapl1缺陷小鼠RPE细胞自噬受损，而DAPL1过表达可增强RPE细胞自噬活性。机制研究表明，DAPL1通过抑制E2F1及c-MYC表达，经DAPK1下调mTOR并上调ATG16及Beclin1，从而促进自噬。上述发现表明，DAPL1是RPE细胞自噬的新型调控因子，其缺失会增加小鼠对年龄依赖性视网膜病变的易感性。

论文解读

研究背景

年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致老年人不可逆视力丧失的主要疾病，其核心病理改变为视网膜色素上皮（RPE）细胞功能衰退与光感受器退化。RPE作为维持视网膜稳态的关键支持细胞，承担氧化应激调节、生长因子分泌、血-视网膜屏障维持及代谢废物吞噬清除等功能。已有证据表明，RPE细胞自噬缺陷与AMD发生密切相关，但具体的分子调控网络仍未完全明确。遗传学研究发现，DAPL1基因内的同义单核苷酸多态性（rs17810398）与AMD风险相关，且前期研究显示DAPL1在成熟RPE细胞中高表达，参与调控细胞增殖、抗氧化防御及上皮-间质转化，但其是否及如何影响RPE自噬仍不清楚。本研究由Huaicheng Chen、Qiufan Tan等作者在《Journal of the Formosan Medical Association》发表，旨在揭示DAPL1在年龄依赖性视网膜病变中的功能及其调控RPE自噬的分子机制。

主要技术方法

研究采用CRISPR/Cas9技术构建Dapl1^?/?小鼠模型，并以同龄野生型C57BL/6J小鼠为对照。实验动物为18月龄小鼠，细胞实验使用ARPE-19细胞系及从同龄小鼠分离的原发性RPE细胞。主要技术手段包括：眼底照相与OCT活体成像评估视网膜形态变化；组织病理学及免疫荧光染色检测视网膜与RPE结构及分子标记；油红O染色分析脂质沉积；Western blot及RT-qPCR检测基因与蛋白表达水平；慢病毒介导的基因过表达及小干扰RNA（siRNA）敲低进行功能验证。

研究结果

3.1 老龄Dapl1^?/?小鼠视网膜呈现年龄依赖性病变

眼底照相及OCT显示，18月龄Dapl1^?/?小鼠视网膜外核层与RPE间出现点状沉积物，组织学与油红O染色证实其为脂质丰富的自身荧光聚集物，并伴随IBA1阳性小胶质细胞浸润，提示RPE应激诱导的小胶质细胞迁移。

3.2 老龄Dapl1^?/?小鼠视网膜及RPE发生病理性损伤

免疫荧光检测显示，老龄Dapl1^?/?小鼠视网膜GFAP表达升高，光感受器标记Rhodopsin与Opsin表达下降，RPE铺片ZO-1染色显示细胞增大、多核化及紧密连接破坏，证实RPE与光感受器均发生显著损伤。

3.3 DAPL1调控RPE细胞自噬

LC3免疫荧光及蛋白分析显示，Dapl1^?/?小鼠RPE中自噬标志ATG16与Beclin1表达降低，mTOR表达升高；在ARPE-19细胞中过表达DAPL1可增加ATG16、Beclin1及LC3-II水平，降低mTOR与p62水平，证实DAPL1促进RPE自噬。

3.4 DAPL1部分通过DAPK1调控RPE自噬

Dapl1缺陷导致RPE中DAPK1表达升高，而过表达DAPL1则降低DAPK1水平；在ARPE-19细胞中过表达DAPK1可抑制自噬，并部分逆转DAPL1诱导的自噬增强效应，表明DAPK1介导DAPL1的部分自噬调控功能。

3.5 DAPL1通过E2F1与c-MYC调控DAPK1表达

Dapl1缺陷小鼠RPE中E2F1与c-MYC蛋白水平升高，DAPL1过表达则降低二者表达；敲低E2F1或c-MYC可减少DAPK1表达，而过表达二者则增加DAPK1水平，并在DAPL1过表达的细胞中逆转其对mTOR、ATG16及Beclin1的调控作用，证实DAPL1通过抑制E2F1/c-MYC上调DAPK1。

讨论与结论

本研究首次阐明DAPL1通过E2F1/c-MYC-DAPK1-mTOR/ATG16/Beclin1信号轴促进RPE自噬，维持视网膜稳态。Dapl1缺陷小鼠在衰老过程中表现出RPE结构与功能退化、脂质沉积及继发性光感受器损伤，模拟了年龄相关性视网膜病变的特征。研究结果不仅揭示了DAPL1在RPE自噬调控中的新功能，也为理解AMD等年龄相关性视网膜疾病的发病机制提供了重要线索。靶向DAPL1-自噬轴有望成为干预视网膜蛋白稳态失衡相关疾病的新策略。