开发一种同时提取结合超高效液相色谱-加热电喷雾电离-四极杆-轨道阱质谱（UHPLC-HESI-Q-Orbitrap-MS）的检测流程用于测定动物源性食品中10种前致癌性N-亚硝胺

《Journal of Food Composition and Analysis》：Development of a simultaneous extraction and UHPLC-HESI-Q-Orbitrap-MS workflow for the determination of 10 pro-carcinogenic N-Nitrosamines in animal derived foods

研究人员开发了一种灵敏且选择性的分析方法，用于同时测定加工肉制品、鱼类及乳制品中10种前致癌性N-亚硝胺（NAs），包括N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基-N-甲基乙胺（NMEA）、N-亚硝基肌氨酸（NSAR）、N-亚硝基吗啉（NMOR）、N-亚硝基吡咯烷（NPYR）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基哌啶（NPIP）、N-亚硝基二正丙胺（NDPA）、N-亚硝基甲基苯胺（NMPhA）及N-亚硝基二正丁胺（NDBA）。通过实验设计优化了以酸化乙酸乙酯（含0.2%甲酸）为溶剂的绿色液固萃取方法，并利用配备加热电喷雾电离源的超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UHPLC-HESI-Q-Orbitrap-MS）进行分析，实现精确质量数鉴定。采用基质匹配校准曲线进行定量，有效克服复杂食品基质中显著的基质效应。方法验证结果显示，线性良好（R2 = 0.9750~0.9987）、回收率满意（60%~110%）、检测限低（0.348~0.848 μg/kg）、定量限低（1.06~2.57 μg/kg），且在所有基质中重现性高。应用于市售样品检测发现，NPYR、NPIP及NDBA呈痕量检出，其中部分烟熏、高脂且硝酸盐与亚硝酸盐含量高的样品中浓度显著升高，提示这些因素可能存在协同作用。

该研究发表于《Journal of Food Composition and Analysis》，针对当前缺乏可同时覆盖挥发性与非挥发性N-亚硝胺（NAs）的标准化检测方法的问题，开发了适用于肉制品、鱼类及乳制品等多基质的分析流程。N-亚硝胺是一类由亚硝化剂与前体胺反应生成的前致癌物，国际癌症研究机构（IARC）将其列为2A或2B类人类致癌物，但目前欧盟尚未制定其在食品中的最大限量标准，主要风险监测集中于加工肉制品，对其他动物源性食品关注不足。已有气相色谱-质谱（GC-MS）方法难以兼顾非挥发性NAs，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）常需多离子化模式切换或复杂净化步骤，限制了高通量应用。本研究首次将液固萃取与超高效液相色谱-加热电喷雾电离-四极杆-轨道阱质谱（UHPLC-HESI-Q-Orbitrap-MS）结合，实现10种目标NAs的同步检测。

关键技术方法包括：采集并均质化32份市售加工肉制品、鱼类及乳制品样品，部分金枪鱼样品进行亚硝酸盐溶液注射处理；采用中心复合设计（CCD）与满意度优化法（DOM）优化液固萃取条件，选用酸化乙酸乙酯为提取溶剂；使用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱进行分离，流动相为含0.1%甲酸的水和甲醇；在加热电喷雾电离源正离子模式下，以选择离子监测（SIM）模式进行高分辨质谱检测；采用基质匹配校准消除基质效应，并通过线性、回收率、精密度等指标完成方法验证；结合AGREE与BAGI指标评价方法的绿色性与适用性。

结果与讨论部分显示，液固萃取优于QuEChERS法，最佳条件为5 mL 100%乙酸乙酯（含0.2%甲酸），可完全提取10种NAs。色谱分离中，Zorbax Eclipse Plus C18柱表现出高分辨率与抗基质干扰能力，HESI源在单一正离子模式下即可有效电离不同极性NAs，无需多模式切换。方法验证结果表明，LOD为0.348~0.848 μg/kg，LOQ为1.06~2.57 μg/kg，R2均高于0.975，回收率为61%~110%，RSD_r低于15%，符合欧盟SANTE/11312/2021与Regulation (EU) 2023/915的性能要求。绿色性评价AGREE得分为0.61，BAGI得分为77.5，表明方法在减少溶剂消耗与操作复杂性方面具有优势。

实际样品检测显示，大部分样品NAs含量低于LOD，仅在烟熏肉制品（如speck）与烟熏奶酪中检出NPIP与NPYR，其中speck 4样品中NPIP高达41.0 μg/kg，该样品硝酸盐与亚硝酸盐含量高、脂含量高且熟化期长。烟熏工艺、亚硝酸盐/硝酸盐水平及储存时间与NAs生成存在相关性，脂质可能通过促进亚硝化反应增强NAs形成，但在高脂样品如无NAs检出的培根中未观察到一致规律。研究结论指出，该方法灵敏度足以支持全球最严格限量标准的合规监测，结果证实烟熏与长时间熟化结合硝酸盐/亚硝酸盐的存在是NAs生成的关键工艺因素，为动物源性食品中亚硝胺的风险评估提供了可靠的分析工具与污染特征数据。