利用分子动力学模拟（Molecular Dynamic Simulations）设计多表位疫苗（Multi-epitope Vaccine, MEV）以对抗无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）感染

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Combating Streptococcus agalactiae infections by designing a multi-epitope vaccine using molecular dynamic simulations

　　

目的：利用无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）2603 V/R菌株的毒力蛋白构建一种多表位疫苗（MEV）。 背景：无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）2603 V/R菌株是新生儿、孕妇以及患有重大基础疾病的老年患者各类疾病和感染的病原体。世界卫生组织（WHO）报告了数量庞大的新生儿死亡和死产病例。多项研究表明，目前尚无针对无乳链球菌（GBS）引起的脑膜炎的 licensed vaccine（许可疫苗）。因此，迫切需要开发针对无乳链球菌（GBS）的新预防方法。 目标：1. 从无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）2603 V/R的蛋白质组中识别抗原蛋白。2. 从筛选出的蛋白中识别表位。3. 利用筛选蛋白的表位设计多表位疫苗（MEV），并通过对接分析和模拟研究进行验证。 方法：分析病原体无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）2603 V/R菌株的蛋白，以获得抗原蛋白，随后研究人员利用各种基于反向疫苗学（Reverse Vaccinology）的工具进一步用于B细胞和T细胞表位预测。最后，通过应用免疫信息学（Immunoinformatics）方法设计了MEV构建体。进行分子对接分析以更好地理解结合能，并使用分子动力学模拟（Molecular Dynamic Simulations）进行进一步验证。 结果：使用27个预测的表位筛选了4个靶蛋白用于MEV构建，对接分析表明疫苗与TLR、MHC I和MHC II的相互作用结合能分别为?40.862 kcal/mol、?43.866 kcal/mol和?56.942 kcal/mol。模拟研究表明，与免疫和MHC受体复合的疫苗在模拟时间内是稳定的。 结论：分离出的毒力蛋白为开发高效、高特异性和安全的MEV构建体提供了关键靶点的见解。预期的疫苗构建体有望为大多数人提供针对无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的长期免疫力。

论文解读：利用分子动力学模拟设计抗无乳链球菌感染的多表位疫苗研究

研究背景与意义

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，又称B组链球菌，Group B Streptococcus, GBS）是一种革兰氏阳性细菌，是新生儿、孕妇以及免疫力低下人群（如患有糖尿病、癌症或肝硬化的老年人）发生严重疾病和感染的主要病原体。该菌通常定植于健康成人的微生物组中，但可转变为高度侵袭性病原体，导致新生儿早发性和晚发性感染、菌血症、脑膜炎等，世界卫生组织（WHO）数据显示其与约10万例新生儿死亡和至少4.6万例死产相关。目前，尽管针对其他细菌病原体的荚膜型疫苗已有开发，但尚无 licensed vaccine（许可疫苗）可用于预防由GBS引起的脑膜炎，且抗生素耐药性日益增加，因此亟需开发新的有效预防手段。本研究正是基于此背景，利用生物信息学和免疫信息学（Immunoinformatics）方法，针对无乳链球菌2603 V/R菌株（血清型V）设计一种多表位疫苗（Multi-epitope Vaccine, MEV），以期提供长期且广泛的免疫保护，该论文发表于《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。

主要关键技术方法

研究人员采用了基于反向疫苗学（Reverse Vaccinology）的计算机模拟（In silico）流程。首先，从UniprotKB获取无乳链球菌2603 V/R的完整蛋白质组，依次通过CD-HIT去除冗余旁系同源蛋白、DEG数据库筛选必需蛋白、PSORTb进行亚细胞定位预测（筛选胞外、膜和细胞壁蛋白）、Deep TMHMM预测跨膜螺旋、Phobius预测信号肽，并结合Algpred2.0和VaxiJen v2.0进行非过敏性及抗原性筛选，通过VFDB和BLASTp比对人类蛋白组数据筛选毒力且非人类同源的靶蛋白。随后，利用IEDB等工具预测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位、辅助T细胞（HTL）表位及线性B细胞（LBL）表位，并进行种群覆盖率分析。接着，研究人员构建MEV序列（包含佐剂、连接子和表位），利用ProtParam、SOPMA、AlphaFold进行理化性质分析、二级和三级结构预测，并通过ProSa-web、ERRAT和Ramachandran plot进行结构验证。最后，使用PyDock进行MEV与TLR2、MHC I（PDB: 1I1Y）、MHC II（PDB: 1KG0）的分子对接（Molecular Docking），并利用GROMACS 2023.2在OPLS AA/L力场下进行了100 ns的分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulations, MD），分析RMSD、RMSF、Rg和SASA等参数以评估复合物稳定性。

研究结果

3.1 蛋白质组筛选（Proteome screening）

从无乳链球菌（UniProt: UP000000821，共2105个蛋白）出发，经CD-HIT去冗余后保留2092个非旁系同源蛋白，DEG筛选得到1336个必需蛋白，PSORTb亚细胞定位筛选出408个胞外/膜/细胞壁/分泌蛋白，Deep TMHMM筛选出175个含0-1个跨膜螺旋（TMHs）的蛋白，Phobius最终确定11个含有信号肽的蛋白。

3.2 毒力和抗原蛋白预测（Virulent and antigenic proteins prediction）

在上述11个蛋白中，8个为非过敏性，其中5个具有高抗原性（VaxiJen评分≥0.5）且分子量大于100 kDa。经BLASTp比对毒力因子数据库（VFDB）确认4个毒力蛋白：锌ABC转运蛋白/锌结合粘附脂蛋白（UniProt: Q8E128）、细胞壁表面锚定家族蛋白（UniProt: Q8DYR9）、细胞壁表面锚定家族蛋白（UniProt: Q8E0S8）以及C5a肽酶（UniProt: Q8E1E1）。这4个蛋白经BLASTp比对人类蛋白质组无非同源序列，且Swiss Model预测的结构经ERRAT评估质量良好（评分90.43-97.10）。

1. 4.
   预测T细胞和B细胞表位的选择（Selection of predicted T-cell & B-cell epitopes）
   针对4个靶蛋白，预测并筛选出17个最佳的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位（12-mer，非毒性、非过敏性、高抗原性和免疫原性）、2个最佳辅助T细胞（HTL）表位（15-mer，可诱导IFN-γ、IL-4和IL-10）以及8个最佳线性B细胞（LBL）表位（16-mer）。种群覆盖率分析显示，所选表位在全球的综合分布覆盖率为60.72%，其中欧洲最高（85.48%），北美次之（82.15%），中美洲最低（4.22%）。

4.2 多表位疫苗（MEV）构建（Multi-epitope vaccine (MEV) construct）

研究人员将17个CTL表位、2个HTL表位和8个B细胞表位与霍乱毒素B亚基（CTB, Accession: P01556）佐剂通过EAAAK、AAY、GPGPG和KK连接子连接，构建了长度为565个氨基酸的MEV序列。理化性质分析表明，该MEV分子量约为63.41 kDa，无跨膜螺旋，脂肪族指数为75.08，不稳定指数（II）为34.56，亲水性平均值为-0.392，平均半衰期较长，且为非负过敏性、非毒性、高抗原性（评分0.79）。二级结构预测显示41.77%为α-螺旋，22.65%为β-折叠，26.90%为无规卷曲。AlphaFold预测的三级结构经Ramachandran plot分析显示92.9%的残基位于允许区，ERRAT质量为87.149，Qmean得分为-5.88。此外，MEV构建体本身预测出17个构象B细胞表位和9个线性B细胞表位。

4.3 MEV与TLR2、MHCI和MHCII的分子对接分析（Molecular docking analysis of MEV with TLR2, MHCI and MHCII）

蛋白-蛋白对接结果显示，MEV与TLR2、MHC I和MHC II的结合能分别为-40.862 kcal/mol、-43.866 kcal/mol和-56.942 kcal/mol，均为负值，表明具有强结合亲和力。非共价相互作用分析（COCOMAPS 2.0）显示，在100 ns模拟时间内，MEV-MHC I的相互作用分布从26.2%增加，氢键从3.3%增至6.4%；MEV-MHC II从16.5%增至46.8%，氢键从2.4%增至6.4%；MEV-TLR2从26.2%增至50.3%，氢键从2%增至3%。

4.4 分子动力学模拟（Molecular dynamics simulations）

对三个对接复合物进行100 ns MD模拟。RMSD（均方根偏差）分析表明，MHC II-MEV复合物表现最稳定，波动最小；MHC I-MEV复合物波动相对较大（可达2.5 nm），可能源于MEV柔性连接区或表位边界的重定位；TLR2-MEV复合物介于两者之间。RMSF（均方根波动）分析显示MHC II-MEV残基波动较小，MHC I-MEV在640-750残基处波动较大（超过2 nm）。Rg（回转半径）分析表明所有复合物在模拟期间均保持紧凑，未发生解折叠或结构破裂，TLR2-MEV初始从4.2 nm降至约3.5 nm后稳定，MHC I-MEV稳定在3.4 nm，MHC II-MEV后期稳定在4.2 nm。SASA（溶剂可及表面积）分析显示所有复合物的SASA随时间的推移而降低，表明氨基酸残基与溶剂的接触减少，界面埋藏紧密，其中MHC II-MEV可及面积相对较大，MHC I-MEV最为紧凑。

讨论与结论总结

本研究利用计算机模拟技术，成功识别了无乳链球菌2603 V/R菌株的关键毒力和抗原蛋白（锌转运蛋白、表面锚定蛋白和C5a肽酶等），并基于预测的CTL、HTL和B细胞表位构建了由565个氨基酸组成的多表位疫苗（MEV）构建体。该MEV具有稳定的理化性质、良好的结构质量以及高抗原性、非毒性和非过敏性特征。分子对接和100 ns分子动力学模拟证实，该MEV能与人类免疫受体（TLR2、MHC I和MHC II）形成稳定且强亲和力的复合物，在模拟时间内结构完整、紧凑且相互作用持续增强。尽管目前尚无针对GBS的许可疫苗，且抗菌药物耐药性上升，但该研究的发现为开发高效、高特异性且安全的MEV提供了关键靶点见解，预期能为大多数人群提供针对无乳链球菌的长期免疫力，尤其在血清型V流行的北美地区种群覆盖率超过85%。研究人员指出，受限于计算工具的局限性，该MEV构建体已具备进行后续实验（如免疫学测定）的条件，以进一步确定其生物效价。