AnkB是一种来自霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的锚蛋白重复序列（ankyrin repeat）蛋白，它作为血红素伴侣蛋白（heme chaperone）参与过氧化氢酶（catalase）的成熟过程

《Journal of Inorganic Biochemistry》：AnkB, an ankyrin repeat protein form Vibrio cholerae, functions as a heme chaperone for catalase maturation

　　

内田武（Takeshi Uchida）|本上渡（Wataru Motegi）|宫下彩奈（Ayane Miyashita）|龙宫明信（Akinobu Tatsumia）|石森康一郎（Koichiro Ishimori）

日本北海道大学理学部化学系，札幌060-0810

摘要

AnkB是一种含有ankyrin重复序列的蛋白质，来自霍乱弧菌（Vibrio cholerae）。在这项研究中，我们探讨了它在促进血红素（heme）结合到过氧化氢酶（catalase）中的作用，过氧化氢酶是一种能够将过氧化氢转化为分子氧和水的酶。为了获得可溶性蛋白质，我们表达并纯化了一个截短的构建体ΔAnkB，该构建体缺少预测的跨膜区域。光谱血红素滴定实验表明，ΔAnkB与血红素的结合和解离常数（K_d）为0.17?μM，与过氧化氢酶（KatB的解离常数0.38?μM相当）。尽管突变研究未能确定确切的血红素结合残基，但重组突变体的吸收光谱表明Tyr95和Tyr87参与了血红素的配位。蓝色Native-PAGE和尺寸排阻色谱分析未检测到稳定的ΔAnkB-KatB复合物；然而，动力学分析显示ΔAnkB向无血红素的KatB（apo-KatB）转移血红素的过程是高效的，具有快速相（k?≈?1.35?s^?1）和慢速相（k?≈?0.013?s^?1）。值得注意的是，当使用无血红素的肌红蛋白（apo-myoglobin）作为受体时，快速相不存在，这表明ΔAnkB与KatB的相互作用是短暂的且特异性的，从而促进了血红素的直接转移，而不仅仅是简单的溶解在溶剂中。基因组分析显示ankB与katB的邻近关系进一步支持了其在KatB成熟过程中的生理作用。这些发现表明AnkB通过促进KatB成熟过程中的血红素结合，为霍乱弧菌的抗氧化防御机制做出了贡献。

引言

血红素（heme）是原卟啉IX（PPIX）的铁复合物，是多种血红蛋白（包括肌红蛋白、细胞色素和细胞色素P450）的基本辅因子[1]。由于血红蛋白参与多种生理过程，血红素在所有生物体中普遍存在。尽管血红素不可或缺，但由于其能够催化活性氧的生成，游离的血红素具有高度毒性。因此，细胞维持严格的调控机制来控制血红素的合成、运输和利用。

在真核生物中，血红素生物合成的最后一步发生在线粒体中，其中铁螯合酶（ferrochelatase）将亚铁插入卟啉环[2]，[3]。新合成的血红素随后被输出到细胞质中，并被弱血红素结合蛋白（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）[4]、[5]和谷胱甘肽S-转移酶（GST）[6]、[7]捕获，从而减轻血红素的毒性。孕酮受体膜组分1（PGRMC1）也被认为是一种细胞质血红素伴侣蛋白，能够将血红素传递给无血红素的血红蛋白，包括铁螯合酶和细胞色素P450酶[8]、[9]、[10]。此外，哺乳动物细胞中P450异构体3A4和2D6的成熟依赖于GAPDH和Hsp90介导的血红素协同传递[11]。这些伴侣蛋白具有适度的血红素亲和力，能够高效捕获和定向转移血红素。

细菌也能合成血红素，尽管某些物种通过专门的摄取途径从环境中获取血红素。在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中，血红素通过Phu系统被导入[12]、[13]，外膜蛋白PhuR结合血红素并将其传递给周质穿梭蛋白PhuT[15]，后者再将其传递给ABC转运蛋白PhuUV以进入细胞质[12]。在细胞质中，血红素被PhuS捕获并分配给目标蛋白[16]、[17]。大多数革兰氏阴性细菌都具有类似于铜绿假单胞菌的血红素摄取系统。例如，霍乱弧菌利用Hut（heme utilization）蛋白来获取血红素[18]。霍乱弧菌中的HutX将血红素传递给HutZ[19]，通过这一过程血红素被降解并释放铁[20]、[21]。此外，先前被研究用于铁转运的铁伴侣蛋白CyaY[22]、[23]也被证明能在霍乱弧菌中结合血红素并参与血红素的运输[24]。这些例子突显了细菌在安全运输血红素方面的多样性。

过氧化氢酶（catalase）是一种血红素酶，可将过氧化氢（H₂O₂）分解为水（H₂O）和分子氧[25]。由于过氧化氢在有氧代谢和免疫反应中不断产生，过氧化氢酶在有氧生物中几乎普遍存在。尽管对过氧化氢酶进行了广泛的生化研究，但其血红素获取机制仍不甚明了。有人提出ankyrin重复序列蛋白可能作为过氧化氢酶的血红素伴侣蛋白[26]、[27]。Ankyrin重复序列是由33个残基组成的结构基序，已知能介导蛋白质-蛋白质相互作用[28]。来自空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的Cj1386是一种ankyrin重复蛋白，它能结合血红素并参与过氧化氢酶的激活[29]，这表明Cj1386可能负责将血红素传递给过氧化氢酶。

霍乱弧菌拥有一种与Cj1386同源的蛋白质VC1584（以下简称AnkB），两者序列相似度为69.2%（图S1）[30]。ankB基因位于编码过氧化氢酶（KatB；VC1585）和超氧化物歧化酶（SOD；VC1583）的基因附近，这两种酶都参与氧化应激防御。这种基因组组织表明AnkB可能参与KatB的成熟过程。因此，在本研究中，我们表达了AnkB，研究了其血红素结合特性，并考察了其将血红素直接传递给无血红素的KatB的能力。

章节片段

材料

所有化学品均购自FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）、Nacalai Tesque（日本京都）或Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），使用前无需进一步纯化。

AnkB和KatB的表达与纯化

来自霍乱弧菌的经过密码子优化的ankB（UniProt条目Q9KRQ2）和katB（UniProt条目Q9KRQ1）基因购自Eurofins Genomics（日本东京）。每个基因通过聚合酶链反应（PCR）扩增后克隆到pGEX-6P-1（瑞典乌普萨拉Cytiva）和pET-28b（Merck Millipore）载体中

AnkB的表达与纯化

最初，霍乱弧菌的AnkB全长蛋白以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达，但大部分表达的蛋白以包涵体形式存在于不溶性组分中（图S2A）。根据SOSUI[36]和AlphaFold3（图S2B）的预测，N端附近存在跨膜结构域（Met11-Val33），这可能是导致聚集的原因。为了提高溶解性，我们构建了一个缺失前38个氨基酸残基的截短突变体，包括预测的跨膜区域

讨论

在霍乱弧菌中，我们最近发现了几种非典型的血红蛋白，它们的生物学功能受血红素结合的调节。例如，卟啉胆色素原脱氨酶（PBGD）是一种血红素生物合成酶，可催化四个卟啉胆色素原分子生成1-羟甲基胆色素[39]、[40]，它通过Cys105和His227结合血红素，结合亲和力为0.33?μM，结合血红素后催化活性下降15%[41]。另一个例子是铁摄取调节蛋白

结论

CRediT作者贡献声明

内田武（Takeshi Uchida）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，监督，资金获取。本上渡（Wataru Motegi）：实验研究，数据分析。宫下彩奈（Ayane Miyashita）：数据分析。龙宫明信（Akinobu Tatsumia）：实验研究，数据分析。石森康一郎（Koichiro Ishimori）：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。

资助

本研究得到了JSPS KAKENHI资助（项目编号：JP19H05769（K.I.）和JP20K05700（T.U.）的支持。

利益冲突声明

作者声明与本文内容无利益冲突。

致谢

我们感谢龙宫明信（Akinobu Tatsumi）使用AlphaFold3预测AnkB全长结构以及进行AnkB与血红素对接模拟的帮助。