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作者：Hou Caixia、Thamban Chandrika Nishad、Leggas Markos、Garneau-Tsodikova Sylvie、Tsodikov Oleg V.
所属单位：美国肯塔基大学药学院药学科学系，地址：789 S. Limestone St.,
作者：Hou Caixia、Thamban Chandrika Nishad、Leggas Markos、Garneau-Tsodikova Sylvie、Tsodikov Oleg V.
所属单位：美国肯塔基大学药学院药学科学系，地址：789 S. Limestone St., Lexington, KY 40536
摘要
Trabectedin是一种具有强抗癌活性的DNA结合天然产物，目前全球范围内被用于治疗软组织肉瘤和卵巢癌。然而，Trabectedin与DNA的晶体结构长期以来一直未能被确定。本研究报道了Trabectedin与DNA形成的共价复合物的晶体结构，分辨率为1.8 ?。该结构显示了Trabectedin在DNA小沟中的结合形式及其位置，并揭示了药物与DNA之间的多种相互作用，以及它们结合后导致的DNA和Trabectedin构象变化。这一发现有助于进一步阐明Trabectedin的作用机制，并为改进Trabectedin类化合物的设计提供依据。
引言
Trabectedin（商品名Yondelis?）是一种DNA烷基化抗癌药物，被广泛用于治疗对蒽环类药物耐药的晚期软组织肉瘤，也可与多柔比星联合使用治疗卵巢癌[1]。此外，Trabectedin单药或与其他药物联合使用正在进行多项临床试验，以评估其对多种肉瘤（包括Ewing肉瘤，临床试验编号NCT04067115）的治疗效果。研究表明，Trabectedin的作用机制之一是阻断致癌转录因子EWS-FLI1与DNA的结合[2]。Trabectedin最初于1986年从海鞘动物Ecteinascidia turbinata中分离得到[3]，最初的研究目的是探究其抗癌活性的来源。后来发现这种化合物实际上是由海鞘的细菌共生体Candidatus Endoecteinascidia frumentesis合成的[4]。由于无法从其天然来源或通过全合成方法获得足够的Trabectedin量用于医疗用途（参考文献5, 6），且该共生体难以培养，因此人们选择通过半合成方法从cyanosafracin B制备Trabectedin[7]。实验表明，Trabectedin对小鼠体内多种异种移植瘤及患者体内提取的肿瘤（包括卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤）具有显著的抗癌效果[8, 9]。其抗癌作用源于其与双链DNA的结合，该化合物可 reversibly 乙基化DNA小沟中的鸟嘌呤残基N2位点，但不会与单链DNA结合[10]。Trabectedin主要优先作用于CGG、GGC、AGC、GGG、TGG和TGC序列中的G位点[10]。该化合物对具有高效转录耦合核苷酸切除修复（TC-NER）能力的细胞具有毒性，而这种损伤无法被全局基因组核酸修复（GG-NER）机制修复[11]。Trabectedin的毒性依赖于人类细胞中的内切酶XPG及其在裂殖酵母中的同源物Rad13的存在，而非其催化活性[12, 13]。最近的研究进一步阐明了这一机制：Trabectedin与DNA结合后，会抑制内切酶XPG引发的第二次DNA切割，从而导致NER内切酶XPF产生的单链DNA断裂累积[14]。
1992年，研究人员发表了Trabectedin N12-氧化物衍生物及其类似物ET-729的晶体结构[15]，随后又获得了Trabectedin本身的相似晶体结构[16]，这些结果证实了之前基于核磁共振（NMR）光谱得出的结构预测[16]。通过将Trabectedin的结构对接到DNA寡聚体上，并结合NMR数据确定的原子间距约束条件进行分子动力学模拟，构建了Trabectedin-DNA复合物的计算模型[17]。模拟结果显示，Trabectedin与DNA结合后会使DNA的小沟变宽并稍微向大沟方向弯曲[18]。这一预测与电泳凝胶迁移数据得出的17°弯曲角度一致[19]。目前尚未获得Trabectedin-DNA复合物的实验测定结构，该结构将有助于揭示两者之间的相互作用及复合物形成的构象变化，为后续研究Trabectedin的作用机制及类似物的抗癌药物开发提供重要线索。本研究详细描述了Trabectedin-DNA复合物的结晶过程、结构测定及表征方法。
章节片段
Trabectedin-DNA结合物的结晶及其S-C20键的放射断裂
研究人员使用含有一个肌苷（I）碱基的12聚体DNA序列ATAGCTAICTAT（自退火所得）成功制备了Trabectedin-DNA复合物晶体，其中每条链上分别包含一个I和一个G。肌苷的存在对晶体结构没有显著影响，因为复合物的结构是通过与蛋白质-DNA复合物中的类似序列进行分子替换得到的[8]。此外，先前的研究也证实了肌苷不会对晶体结构产生显著干扰[9]。
讨论
Trabectedin及其新型类似物目前已在临床研究中用于治疗肉瘤和其他癌症，因此深入理解其作用机制的分子细节对于提升其安全性和疗效至关重要。由于这些化合物的合成过程较为复杂，基于结构的合理设计显得尤为重要。Trabectedin-DNA复合物的晶体结构明确了其结合方式，表明药物和DNA在结合过程中均发生了构象变化。
结晶过程
将单链12聚体DNA寡核苷酸5'-ATAGCTAICTAT-3'（其中I代表肌苷碱基，购自IDT）溶于退火缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，室温調节，10 mM NaCl），然后加热至95°C后再逐渐冷却至4°C进行自退火。Trabectin（Cayman Chemical公司产品）以50 mM的浓度溶解在DMSO中。退火后的双链DNA与Trabectin混合后使用……（后续说明省略）
CRediT作者贡献声明
Hou Caixia: 负责撰写、审稿与编辑、数据可视化、实验设计、数据分析及结果分析。Thamban Chandrika Nishad: 负责撰写、审稿与编辑、实验设计、数据分析及结果分析。Markos Leggas: 负责撰写、审稿与编辑、研究概念的构建。Sylvie Garneau-Tsodikova: 负责撰写、审稿与编辑、数据分析。Oleg V. Tsodikov: 负责初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目统筹、实验设计、数据分析及研究概念的构建。
资金支持
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的R01CA243529项目资助（项目负责人：OVT）。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
感谢布鲁克海文国家实验室（Brookhaven National Laboratory）的国家同步辐射光源II（NSLS-II）19-ID（NYX）光束线的Kevin Bataille在远程数据收集方面提供的协助。
数据与材料获取晶体学数据及晶体结构已上传至蛋白质数据库，相关编号分别为11BK（放射断裂的Trabectedin-DNA复合物）和11BJ（完整的Trabectin-DNA复合物）。
