用于对抗β-内酰胺酶介导的抗生素耐药性的两性离子青霉素衍生的砜抑制剂

《ChemMedChem》：Zwitterionic Penicillin-Derived Sulfone Inhibitor for Combating β-Lactamase-Mediated Antibiotic Resistance

　　

β-内酰胺类抗生素约占细菌感染所有处方量的近70%，仍然是抗菌化疗的基石。然而，其临床疗效正日益受到β-内酰胺酶介导的耐药性广泛出现的损害。这些酶通过加成-消除机制水解β-内酰胺环，从而消除抗菌活性。因此，保护β-内酰胺类抗生素（特别是被视为多重耐药（MDR）病原体最后防线的碳青霉烯类）的疗效至关重要。在此，研究人员报告了化合物3的设计与合成，这是一种两性离子青霉素衍生的砜，整合了两个关键原则：两性离子分子增强的渗透性，以及通过在舒巴坦（sulbactam）骨架内引入(2-吡啶基)亚甲基以实现抗水解的稳定加合物，从而提高抑制效力。体外测定表明，化合物3显著恢复了针对产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶的MDR病原体的β-内酰胺活性。它显著改善了亚胺培南（imipenem）和头孢他啶（ceftazidime）对表达OXA-48和PDC-1的菌株的疗效，其抑制能力通过分离酶的动力学分析确定。使用质谱和分子动力学（MD）模拟的机理研究揭示了配体诱导的口袋形成、π-堆叠调节和疏水相互作用，支持通过吲哚里嗪（indolizine）加合物形成的水屏蔽共价失活途径。化合物3中非空间位阻的胺有利于PDC-1结合和整体渗透性，同时对OXA-48结合具有中性影响。这些结果强调了化合物3作为下一代β-内酰胺酶抑制剂，用于对抗由ESBL和产碳青霉烯酶肠杆菌目以及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）引起的感染的潜力。

用于对抗β-内酰胺酶介导的抗生素耐药性的两性离子青霉素衍生的砜抑制剂——论文解读

研究背景与意义

β-内酰胺类抗生素（包括青霉素类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类）在临床使用七十余年后，仍占据细菌感染处方量的约70%，是抗菌化疗的基石。其中，碳青霉烯类常被视为“最后一线”抗生素，是治疗多重耐药（MDR）感染的唯一剩余选择。然而，细菌已进化出复杂的策略来逃避这些救命药物，其中产生药物灭活酶——特别是β-内酰胺酶——是最普遍且具有临床意义的耐药机制。这些酶通过加成-消除机制高效水解β-内酰胺环，使化合物失活并废除其靶向必需细菌过程的能力。β-内酰胺酶介导的水解构成了革兰氏阴性病原体中抗生素耐药的主要原因。最具临床相关性的MDR分离株包括：产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的肠杆菌目（对大多数广谱β-内酰胺类耐药）；以及碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和肠杆菌目，其碳青霉烯耐药主要由获得性碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶（如OXA-23、OXA-24/40和OXA-48）驱动。

为应对这一挑战，近期努力集中在利用β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺抗生素联用，以最小化β-内酰胺酶的影响并恢复药物疗效。然而，设计小分子抑制剂阻断β-内酰胺酶活性极具挑战性，因为这些酶在氨基酸序列和活性位点架构上表现出显著多样性（迄今已报道超过12,700种变体），并具有不同的催化策略（丝氨酸水解酶介导的共价催化或锌依赖水解酶驱动的非共价催化），且病原体常同时产生多种β-内酰胺酶。因此，开发能有效靶向这种多样化阵列的广谱抑制剂仍是抗菌药物设计中的巨大挑战。目前已获FDA批准的抑制剂包括DBOs（如阿维巴坦（avibactam）、雷利巴坦（relebactam）、度洛巴坦（durlobactam））、环状硼酸盐衍生物（如瓦博巴坦（vaborbactam））以及青霉素衍生的砜类（如舒巴坦（sulbactam）、他唑巴坦（tazobactam））。研究显示，能够进入革兰氏阴性菌孔蛋白的药物通常具有非空间位阻的胺和一些非极性功能，且电荷分布对渗透性至关重要，这解释了两性离子化合物通常具有更高渗透率的原因（如恩美他唑巴坦（enmetazobactam））。此外，在舒巴坦C6位引入(2-吡啶基)亚甲基（化合物1）可因其形成的抗水解吲哚里嗪（indolizine）加合物而显著增强对β-内酰胺酶的效力；进一步优化（如LN-1-255引入儿茶酚部分以通过铁摄取途径内化）显示出对OXA-48等的高效抑制。

鉴于两性离子化合物的吸引人特性以及(2-吡啶基)亚甲基衍生物的良好结果，研究人员旨在将两者结合在单一骨架中。本研究报告了化合物3的合成——一种在6位修饰有非空间位阻胺的(2-吡啶基)亚甲基的两性离子青霉素衍生砜。研究人员评估了化合物3在体外恢复β-内酰胺抗生素针对产生ESBLs（A和C类）及碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶的难治性病原体效力的能力，进行了相关酶的动力学研究，并通过质谱和分子动力学模拟研究了其作用和结合模式。

主要关键技术方法

研究人员从市售(+)-6-氨基青霉烷酸（6-APA）和甲基4-溴吡啶-2-甲酸酯出发，以Wittig反应为关键步骤引入(吡啶-2-基)亚甲基部分，经过约十步合成化合物3。体外活性研究采用微量稀释法（CLSI指南）测定了不同菌株（包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产GES-6的临床分离株产气克雷伯菌）在化合物3（16 μg mL^?1）存在或缺失下对氨苄西林（AMP）、头孢他啶（CAZ）和亚胺培南（IP）的最低抑菌浓度（MIC），并以阿维巴坦（avibactam）作为对照。动力学参数（IC₅₀、K_I、K_{i app}、k_inact和k_inact/K_I）通过使用硝基cefin作为底物测定化合物3对PDC-1、OXA-48和OXA-23的抑制活性来确定。作用机制研究包括用NaOMe处理化合物3监测吲哚里嗪衍生物形成的UV-Vis光谱和HPLC-MS分析；结合模式研究采用GOLD程序对接，并使用AMBER 20 ff14SB力场对PDC-1（PDB ID 4GZB）和OXA-48（PDB ID 4S2N）进行100-200 ns的分子动力学（MD）模拟。细胞毒性评估采用HepG2细胞系的MTT法。

研究结果

2.1 化合物3的合成

化合物3从市售(+)-6-氨基青霉烷酸（10）通过Wittig反应作为关键步骤引入(吡啶-2-基)亚甲基部分而完成合成。所需鏻盐9首先由甲基4-溴吡啶-2-甲酸酯（4）经五步制备：与N-Boc-丙炔胺的Sonogashira碳-碳交叉偶联、炔烃催化氢化、LiAlH₄还原为醇、Appel反应转化为溴化物、与三苯基膦加热亲核取代。随后，(+)-6-氨基青霉烷酸的羧酸被保护为二苯基甲基酯（化合物11）。胺11氧化脱氨生成酮中间体12，不经纯化即与鏻盐9进行Wittig反应得到化合物13（总分离收率64%）。硫化物13用m-CPBA氧化得砜14（61%），最后用TFA同时脱保护氨基和羧酸基团，随后碳酸氢钠处理得到目标化合物3（44%分离收率）。

2.2 体外活性与酶学研究

化合物3恢复多种β-内酰胺抗生素对抗多样β-内酰胺酶介导耐药病原体的能力通过MIC测定评估。结果显示：对于碳青霉烯酶产菌株，化合物3增加亚胺培南敏感性：对产OXA-48的肺炎克雷伯菌提高32倍（2 μg mL^?1vs 64 μg mL^?1）；对产OXA-23的鲍曼不动杆菌提高4倍（2 μg mL^?1vs 4 μg mL^?1，是阿维巴坦改善的两倍）；对产OXA-24/40的鲍曼不动杆菌提高4倍（16 μg mL^?1，与阿维巴坦相似）。对于ESBL产菌株，与化合物3联用的头孢他啶活性：在产DHA-1的大肠埃希菌和携带PDC-1的铜绿假单胞菌中完全恢复；在产CMY-2和FOX-4的大肠埃希菌中几乎恢复；在产CTX-M-14的大肠埃希菌中提高32倍；在产GES-6的临床分离株中提高16倍（128至8 μg mL^?1）。

动力学分析确认化合物3对PDC-1的参数显著：高亲和力（K_I= 73 nM, IC₅₀= 21 nM），良好失活速率（k_inact= 25 ms^?1），抑制效率（k_inact/K_I= 3.7 × 10⁵M^?1s^?1）。对OXA-48的活性优于阿维巴坦，抑制效率高8倍（1.9 × 10⁴vs 2.4 × 10³M^?1s^?1），归因于更高的结合亲和力和改进的失活速率。对于OXA-23，化合物3的抑制效率与阿维巴坦相当（2.9 × 10³M^?1s^?1），尽管其对OXA-23的亲和力大于阿维巴坦，但失活速率较低。这些数据强调了化合物3对PDC-1和OXA-48这两种极具挑战性的β-内酰胺酶酶的显著活性。

2.3 化合物3的作用机制

为了阐明化合物3对PDC-1和OXA-48酶抑制效力的分子基础，研究人员研究了其作用机制和结合模式。首先用NaOMe处理化合物3监测了β-内酰胺环打开后吲哚里嗪中间体的形成，UV-Vis光谱显示297 nm处初始波段（亚胺中间体I）减少，394 nm处新波段出现（吲哚里嗪衍生物II），HPLC-MS确认了产物。

计算机模拟研究结合模式显示：与PDC-1酶结合时，化合物3的β-内酰胺羰基通过两个氢键锚定在氧阴离子洞（oxy anion hole）中（与S64和S319骨架NH），(2-吡啶基)亚甲基部分埋藏在催化丝氨酸相邻的隧道状口袋中（由螺旋H10折叠形成 upon 配体结合），该口袋包含Lys-Tyr-Lys三联体（K67-Y150-K315）并通过Y150的π-堆叠相互作用限制其灵活性；铵基团与T290和N346侧链（经水分子）及N287骨架羰基形成氢键，稳定H10的开放构象。酰-酶（acyl-enzyme）加合物模拟表明，修饰的催化丝氨酸被H10形成的隧道状口袋屏蔽来自水溶剂，并通过铵基团与N287、Y274和N314侧链等的强氢键稳定。

与OXA-48酶的Michaelis复合物模拟表明，化合物3正确定位于活性位点以利于催化丝氨酸S70亲核攻击：β-内酰胺羰基与S70和Y211（氧阴离子洞）骨架NH形成氢键网络；羧酸基团与R250、T209和S118侧链相互作用（涉及SVV和KTG基序）。(2-吡啶基)亚甲基部分位于活性中心相邻的非极性区域，与I102、W105、V120、W157和L158残基进行有利的疏水相互作用（OXA-48的特征性大疏水口袋）。铵基团朝向溶剂，通过水分子介导的与磺酰胺基的分子内氢键稳定。OXA-48失活（3*酰-酶加合物）模拟显示，形成的吲哚里嗪部分位于活性位点相邻的非极性区域内，增强疏水性并阻碍水解所需水分子的接近；铵链朝向溶剂不影响结合。酰-丝氨酸加合物通过羧酸基团与R250和T209、酯部分与K208的氢键稳定。对比研究显示，舒巴坦在PDC-1中采取不适合催化丝氨酸亲核攻击的构象，在OXA-48中特征疏水区域未被占据，与化合物3形成鲜明对比，与舒巴坦缺乏抑制活性一致。

2.4 细胞毒性测定

化合物3在HepG2细胞系（人肝细胞癌）中的细胞毒性通过MTT法评估（浓度16 μg mL^?1，即39.9 μM），顺铂作为阳性对照。化合物3在这些条件下未显示相关细胞毒性，细胞生长抑制率为3 ± 3%，而顺铂产生60 ± 2%抑制，IC₅₀为15.8 ± 1.4 μM。

讨论与结论

综上所述，研究人员从市售(+)-6-氨基青霉烷酸和甲基4-溴吡啶-2-甲酸酯经十步合成了两性离子青霉素衍生的砜化合物3，Wittig反应为关键步骤。化合物3的设计遵循两个原则：两性离子分子的有利渗透性，以及舒巴坦骨架中(2-吡啶基)亚甲基取代增强的抑制效力。通过在青霉素衍生砜框架中整合带有非空间位阻胺的这两个特征，研究人员旨在利用β-内酰胺酶抑制剂开发中的两个因素。体外研究表明，化合物3显著恢复了β-内酰胺抗生素针对产生ESBL和碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶的MDR病原体的活性。值得注意的是，化合物3改善了亚胺培南和头孢他啶的疗效，特别是对表达OXA-48和PDC-1（两种临床挑战性酶）的菌株。动力学分析确认高亲和力和抑制效率，对OXA-48优于阿维巴坦，对PDC-1显示显著活性。使用质谱和MD模拟的机理研究揭示了其效力分子基础：模拟揭示了PDC-1中的配体诱导口袋形成和π-堆叠控制，以及OXA-48中的疏水口袋参与与强催化基序相互作用。数据支持通过吲哚里嗪加合物形成在两个靶标上的共价、水屏蔽失活途径，同时表明非空间位阻胺主要有利于PDC-1结合和整体渗透性，指向OXA-48结合具有中性影响。这些见解为优化结合两性离子渗透性与靶标定制口袋参与的下一代β-内酰胺酶抑制剂提供了结构-机制指导。化合物3在HepG2细胞中表现出可忽略的细胞毒性，支持其作为对抗β-内酰胺酶介导耐药性（包括携带ESBL和产碳青霉烯酶肠杆菌目、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌）感染的有前景的β-内酰胺酶抑制剂的潜力。