咪唑吡啶氧化引发的阴离子和中性态生物发光反应：从密度泛函理论的角度来看，这两种现象均被归类为电荷转移诱导的发光（CTIL）

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Anion and neutral-state bioluminescence reactions induced by imidazopyridine oxidation: Both identified as charge-transfer-induced luminescence (CTIL) from a density functional theory perspective

　　

吴楠|辛永轩|徐志超|白艳红

中国河南省郑州市郑州轻工业学院食品与生物工程学院

摘要

生物发光是通过荧光素酶催化的荧光素氧化产生的可见光，广泛应用于生物医学成像及相关领域。咪唑吡啶（ImPy）是腔肠藻素型荧光团的核心发光骨架，其氧化会产生一个阴离子二氧杂环丁酮中间体，该中间体通常会发生裂解。这一过程通常涉及取代基之间的电荷转移和自由基电子的形成，这种现象被称为电荷转移诱导发光（CTIL）。阴离子二氧杂环丁酮也可以通过质子化或分子内键合转化为中性形式。尽管中性二氧杂环丁酮同样可以发生裂解并伴随取代基之间的电荷转移，但转移的电荷量很小，因此常常被忽视，导致人们普遍认为中性状态下的裂解不属于CTIL范畴。这两种裂解机制之间的区别尚未得到明确。在这项工作中，我们基于腔肠藻素和呋里马嗪的结构构建了一个ImPy模型。利用密度泛函理论（DFT），我们计算了导致二氧杂环丁酮形成的氧化路径，并研究了其在不同阴离子和中性状态下的裂解情况。评估了电荷转移行为和反应能垒，并通过波函数分析可视化了整个反应过程中自由基电子分布和原子相互作用的变化。我们的结果表明，尽管中性状态下取代基之间的电荷转移量很小，但它仍然是必要的，因为这些微小的电荷转移会引发二氧杂环丁酮的裂解。因此，中性状态下的裂解应被归类为CTIL机制的一部分，与阴离子情况一致。在中性和阴离子状态下，反应都是由于负电荷转移到CCOO四元环上而引发的，这种转移的电荷会导致两个氧原子的解离，从而引发二氧杂环丁酮的裂解。在阴离子状态下，携带大量负电荷的吡嗪胺（PMN）基团作为供体。捐赠的电荷最初驱动CCOO内的两个氧原子分离，随后在二氧杂环丁酮框架内传播，引发C-C键的裂解，最终导致二氧杂环丁酮的解离。在中性状态下，唯一的供体是一个羰基氧原子，捐赠的负电荷仅足以分离两个氧原子，但不足以断裂CCOO环的C-C键。因此，需要额外的能量来增强电荷转移并实现C-C键的完全断裂。通过改变供体基团上的初始负电荷负荷，我们进一步发现较高的负电荷有利于电荷向CCOO的转移，从而降低了反应能垒。

引言

生物发光是通过荧光素酶催化的荧光素氧化产生可见光的现象，为医学和生物学中的强大成像技术提供了基础。[1] 荧光素的独特化学结构使其在酶促氧化时能够生成激发态产物。尽管荧光素酶种类繁多，但荧光素的底物却相对有限。其中，腔肠藻素（CTZ，见图1）[2] 是几种海洋荧光素酶的通用底物，包括Gaussia [3,4]、Renilla [5,6]、Oplophorus [7] 和 Obelin [8] 类型。CTZ 的核心是咪唑吡啶（ImPy）骨架，它通过与 C2、C6 和 C8 位置的三个芳香取代基（分别称为 C2G、C6G 和 C8G）的结合来调控其化学发光活性。最近的研究表明，在特定酶促条件下对这些芳香取代基进行靶向修饰可以显著改变其发光特性 [9,10]。一个显著的例子是呋里马嗪（FMZ，见图1），当它被 nanoKAZ（Oplophorus 荧光素酶的改良 19 kDa 亚基）催化时，其亮度增强且发光持续时间延长，使其非常适合用于成像应用 [9,11]。

有机分子中的氧化化学发光机制通常在化学诱导电子交换发光（CIEEL）框架内讨论，其中二氧杂环丁酮的裂解是由外部供体的分子间电子转移促成的 [12]。然而，ImPy 衍生的中间体二氧杂环丁酮本身带有负电荷，因此可以在没有外部供体的情况下发生分子内电荷转移。这一过程更准确地描述为电荷转移诱导发光（CTIL）[13]。Ding 等人（2017）使用密度泛函理论（DFT）计算了 ImPy 的完整氧化路径：首先在 N7 处发生脱质子化，随后分子氧（O₂）在 C2 处进行亲核攻击，形成 2-过氧-ImPy。随后的环化生成二氧杂环丁酮的 C2–OX–OY–C3 环结构（CCOO），同时伴随着 C3–N4 键的断裂。之后，CO₂ 和吡嗪胺（PMD）基团之间的分子内电荷交换使基态和激发态的势能面对齐，从而引发 OX–OY 和 C2–C3 键的断裂，生成激发的酰胺物种和 CO₂（见图 1）[14]。ImPy 的这种阴离子裂解途径得到了 1,2-二氧杂环丁烷系统的实验证据支持。阴离子酚盐供体通过分子内电荷转移诱导的分解实现高效的单重态化学激发，量子产率接近于 1。在常温条件下，它们的分解速率比未催化的热分解途径快 10⁹ 倍以上 [15]。

尽管取得了这些进展，但仍存在一些机制上的不确定性。虽然最初形成的阴离子二氧杂环丁酮会发生 CTIL（见图 1，途径 1）[14,18,19]，但最近的研究表明，N1 附近的羧酸基团氨基酸残基（例如 tGLuc 中的 E44 [19] 和 RLuc 中的 D118 [6]）可以作为质子供体，可能将阴离子二氧杂环丁酮转化为中性形式（见图 1，途径 2）。在这种中性状态下，OX–OY 和 C2–C3 的裂解仅涉及微弱的电荷转移，这种贡献通常被忽视，因此不被认为是 CTIL 的表现；相反，有人提出了一种熵陷阱机制来解释激发产物的形成 [14,18,20]。此外，还提出了一种替代的裂解途径（见图 1，途径 3），在该途径中，中性二氧杂环丁酮在 C3–N4 键断裂之前保持完整，但仍能产生激发产物 [21]。这三种途径在活化能垒、电荷重分布和电子动力学方面存在显著差异，但这些差异尚未得到充分研究 [18,20]，其背后的物理机制也尚未得到全面解释。

为了解决这些差异，我们建立了一个简化的模型 ImPy–C6G，包括 ImPy 核心和代表 FMZ 中 C6G 取代基的苯基（见图 1，左上角插图）。该模型包括：（1）负责 CTZ/FMZ 氧化反应性的 ImPy 核心；（2）C6G 苯基，其 π 电子云有助于与 ImPy 之间的电荷交换。最初选择 FMZ 中化学稳定的苯基变体是为了避免 CTZ 中存在的酚羟基可能引起的脱质子化干扰，因为这可能会使二氧杂环丁酮裂解过程中的局部电荷分布分析变得复杂。由于甲基桥接，C2G 和 C8G 的取代基与 ImPy 的电子相互作用可以忽略不计，为了降低计算成本，我们将其简化为甲基 [20]。

利用这个 ImPy–C6G 模型，我们确定了二氧杂环丁酮形成的过渡态，并绘制了其通过途径 1（阴离子）、途径 2（质子化中性）和途径 3（C3–N4 保持完整的中性）的完整内在反应坐标（IRC）轨迹。我们的计算证实，所有三种途径都会生成自由基电子，并在自由基存在区域实现基态到激发态的能垒跨越，这与先前的报告一致 [14,18,21]。进一步的电荷分析表明，所有三种途径都是通过向 CCOO 基团的负电荷转移开始的，仅在初始供体的身份上有所不同。在途径 1 中，吡嗪胺基团（PMN，定义为不包括 CCOO 和 O10 氧原子的分子区域）向 CCOO 环提供大量负电荷，捐赠的电荷随后在 PMD 和 CO₂ 基团之间交换，促进 CO₂ 的解离。相比之下，途径 2 和 3 仅依赖 CCOO 对侧的 O10 原子作为供体，它提供的负电荷有限；这种电荷同样在 PMD 和 CO₂ 之间发生轻微但不可忽视的交换，从而实现 CO₂ 的释放。因此，我们得出结论，途径 2 和 3 与途径 1 在本质上是相同的，也应归类为 CTIL 途径。随后，我们将 C6G 的苯基替换为酚基，并调节其质子化状态，以研究供体上的不同负电荷负荷对 CTIL 的影响。计算表明，CTIL 的活化能垒取决于负电荷从供体转移到 CCOO 环的难易程度，而这又受到分子非供体侧的静电势的影响。当供体向 CCOO 的电荷转移在能量上有利时，能垒降低；当这种转移受到阻碍时，能垒增加。

章节片段

方法

ImPy–C6G 和 O₂ 复合物的建模使用了 GaussView6（版本 6.1.1）[22]，随后进行了几何优化、过渡态定位和 IRC 轨迹分析，使用 Gaussian16（版本 C.01）[24] 在基态单重态（S₀）势能面（PES）上进行。频率计算确认中间体（IM）中没有虚模式，每个过渡态（TS）中只有一个虚频率（imag. Freq.），对应的振动模式为

二氧杂环丁酮的形成

二氧杂环丁酮的形成包括三个基本步骤（反应 1–3，包括 O₂ 的添加、环化和 C3–N4 的断裂），涉及从三重态 O₂ 到单重态产物的自旋态转变（见图 2A），这与 Ding 等人（2017）[14] 的研究结果一致；详细的能量和几何结构见补充材料（Dioxetanone Formation Details，图 S1 和 S2）。生成的二氧杂环丁酮中间体称为 IM_3。为了便于后续的分子内分析

结论

本研究利用 DFT 构建了 ImPy 的二氧杂环丁酮氧化模型，ImPy 是 CTZ 的核心化学发光骨架，并系统地研究了其在不同电荷状态下的裂解特性。结果表明，除了阴离子途径外，中性二氧杂环丁酮的裂解机制也具备 CTIL 的机制前提：负电荷定向流入 CCOO、双自由基的形成以及 S₁ 和 S₀ 势能面（PESs）的接近。然而，中性状态下的

CRediT 作者贡献声明

吴楠：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、项目管理、方法学、研究、资金获取、形式分析、数据管理、概念化。辛永轩：撰写 – 原稿、可视化、验证、软件、方法学、研究、数据管理。徐志超：软件、方法学、研究、形式分析、数据管理。白艳红：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了河南省自然科学基金（编号 242300421359、河南省国际科技合作项目（编号 232102520008）以及 河南省高等学校重点科研计划（编号 23A180002）的支持。