《Bone Research》：Decoding cellular communication networks and signaling pathways in bone, skeletal muscle, and bone-muscle crosstalk through spatial transcriptomics in a young male mouse
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骨和骨骼肌是肌肉骨骼系统的 essential components，使运动、承重和系统稳态成为可能。这些组织通过由细胞因子、生长因子和细胞外基质（ECM）蛋白介导的动态骨-肌串扰（bone-muscle crosstalk）进行通讯。这些介质的空间组织对维持
骨和骨骼肌是肌肉骨骼系统的 essential components，使运动、承重和系统稳态成为可能。这些组织通过由细胞因子、生长因子和细胞外基质（ECM）蛋白介导的动态骨-肌串扰（bone-muscle crosstalk）进行通讯。这些介质的空间组织对维持组织完整性至关重要，其破坏会导致骨质疏松症（osteoporosis）、肌肉减少症（sarcopenia）和代谢综合征（metabolic syndrome）等疾病。尽管这种重要性，利用空间转录组学（ST）研究骨-肌相互作用的研究仍然有限。在此，研究人员应用了10x Genomics Visium ST及计算工具（如SMART和CellChat）来反卷积细胞类型组成，并表征小鼠股骨及邻近骨骼肌中的细胞-细胞通讯网络和配体-受体（L-R）相互作用。研究人员鉴定了8种主要细胞类型（红系细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、髓系细胞、单核细胞/巨噬细胞、间充质干细胞（MSCs）和脂肪细胞），它们具有独特的空间转录谱和13个CellChat推断的通路，例如ECM-受体相关（如COLLAGEN、TENASCIN、THBS）和涉及的分泌信号（如VEGF）通路。代表性的L-R配对包括介导成骨细胞到肌肉相互作用的Col1a1/Col1a2-Sdc4，以及COLLAGEN中介导肌肉到成骨细胞相互作用的Col4a1-Sdc4，TENASCIN中的Tnxb-Sdc4，支持肌肉到成骨细胞/肌肉/髓系/内皮细胞通讯，THBS中的Comp-Sdc4，驱动单核细胞/巨噬细胞到成骨细胞/肌肉信号传导，以及VEGF中的Vegfa-Vegfr1/Vegfr2，介导肌肉到内皮/髓系细胞信号传导。免疫染色验证了几种代表性L-R配对与其相应细胞的共定位。此外，独立的小鼠和人类骨scRNA-seq数据集重现了ST中确定的大多数通路和L-R配对，强调了研究人员发现的稳健性和跨物种相关性。总之，研究人员提出了一个初始的空间解析的、全转录组范围的骨-肌细胞间通讯图谱，为分子串扰提供了新的见解，并为未来肌肉骨骼疾病的研究奠定了基础。
研究背景与论文概况：
骨和骨骼肌是肌肉骨骼系统的重要组成部分，不仅作为支撑和运动的结构元素，也是系统稳态的关键调节者。二者之间通过骨-肌串扰（bone-muscle crosstalk）进行动态互作，涉及细胞因子、生长因子和细胞外基质（ECM）蛋白等生化信号以及力学相互作用。这种复杂的通讯对于维持组织稳态、适应机械应力及损伤后修复至关重要。当其调控失调时，会导致骨质疏松症（osteoporosis）、肌肉减少症（sarcopenia）和代谢综合征（metabolic syndrome）等肌肉骨骼及代谢性疾病。尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）增强了我们对肌肉骨骼组织 cellular异质性的理解，但其缺乏空间背景信息，限制了在原位微环境中解读细胞变化或定位空间依赖的细胞间互作的能力。空间转录组学（ST）通过整合高通量基因表达谱与原位定位克服了这一限制，使得研究细胞行为如何受组织结构和细胞间通讯影响成为可能。然而，目前利用ST研究骨-肌相互作用仍较为匮乏，缺乏对骨与肌组织微环境中空间组织及其调控机制的深入理解。为此，研究人员通过对年轻雄性小鼠股骨及邻近骨骼肌进行ST分析，表征细胞通讯网络并描绘配体-受体（L-R）互作信号通路，并通过多重免疫染色及独立的scRNA-seq数据集进行验证。该论文发表在《Bone Research》期刊。
主要关键技术方法：
研究人员主要采用5周龄雄性C57BL/6小鼠的股骨及附着骨骼肌样本（N=1，组织学及空间转录组；另有独立的小鼠及人骨scRNA-seq队列用于验证）。核心技术包括：利用10x Genomics Visium平台（FFPE样本，~55 μm直径斑点）进行空间转录组测序；使用SMART（一种基于标记基因辅助的主题模型算法）进行细胞类型反卷积，鉴定出8种主要细胞类型；应用CellChat（v2.0）推断细胞-细胞通讯网络及L-R互作，并识别13个关键信号通路；通过COMET多重免疫染色技术在组织切片上验证代表性L-R配对的蛋白水平共定位；利用已有的小鼠股骨/胫骨scRNA-seq数据集（4只8-10周龄雄性小鼠）及人股骨头scRNA-seq数据集（3例骨关节炎患者）进行跨平台和跨物种的通讯网络验证。
研究结果：
空间转录组分析以及骨和骨骼肌的细胞类型反卷积
研究人员使用10x Genomics Visium对5周龄雄性C57BL/6小鼠的股骨及邻近骨骼肌进行ST分析，共获得2660个空间斑点，中位每个斑点506个唯一基因。基于H&E图像手动注释为皮质骨、松质骨、骨髓和骨骼肌区域，区域标记基因（如Col1a1、Sp7、Mki67、Myh4等）的表达验证了注释的准确性。鉴于Visium平台的分辨率限制（每斑点捕获多个细胞转录本），研究人员采用SMART算法结合Mouse Cell Atlas和CellMarker 2.0的标记基因进行反卷积，识别出8种主要细胞类型：红系细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、髓系细胞、单核细胞/巨噬细胞、间充质干细胞（MSCs）和脂肪细胞。成骨细胞在皮质骨和松质骨中占主导，MSCs在这些区域也有富集；骨髓中主要为造血细胞（红系、髓系）和内皮细胞；骨骼肌细胞局限于肌肉区域，伴有少量单核细胞/巨噬细胞浸润。差异基因表达及GO分析显示骨与肌肉分别显著富集胶原代谢和肌肉收缩相关术语。
骨和骨骼肌中的细胞-细胞通讯网络
研究人员利用CellChat分析了骨和肌肉中的细胞间通讯。结果显示广泛的通讯网络，红系细胞、内皮细胞和单核细胞/巨噬细胞具有最高水平的通讯（>10个互作），成骨细胞显示中等数量的细胞间通讯但互作多样，骨骼肌细胞与内皮、红系、单核细胞/巨噬细胞和成骨细胞群体有中度通讯，而脂肪细胞在该数据集中未显示显著通讯（可能与低骨髓脂肪量及技术捕获难度有关）。研究人员进一步识别出6种外向信号模式（分别主要由内皮细胞、红系细胞、单核细胞/巨噬细胞、成骨细胞+MSCs、髓系细胞、骨骼肌细胞驱动）和5种内向信号模式（多为多细胞类型共享）。通路分析共确定13个信号通路，包括ECM-受体相关（COLLAGEN、SPP1、THBS、FN1、TENASCIN）、分泌信号（VEGF、MIF、GALECTIN、GAS）及其他（ADGRG、APP、CLDN、MPZ）。
COLLAGEN和SPP1信号通路中调节成骨细胞功能的L-R互作的作用
在COLLAGEN通路中，成骨细胞是关键中枢，具有作为发送者、接收者、介导者和影响者的多重角色。研究人员识别出10个显著的L-R配对，涉及配体Col1a1、Col1a2、Col2a1、Col4a1、Col4a2及受体Sdc4、Cd44。其中Col1a1/Col1a2-Sdc4是主要贡献者，介导成骨细胞到多数细胞群的外向信号及成骨细胞内的自分泌信号。在SPP1通路中，成骨细胞为主要发送者，红系细胞和单核细胞/巨噬细胞为活跃接收者，通过Spp1-Cd44配对互作，并在成骨细胞、单核细胞/巨噬细胞和红系细胞中观察到强自分泌信号。
THBS和FN1信号通路中调节单核细胞/巨噬细胞功能的L-R互作的作用
在THBS通路中，单核细胞/巨噬细胞是主要发送者、接收者、介导者和影响者，成骨细胞主要为接收者。识别出6个显著L-R配对（配体Thbs1、Comp；受体Cd47、Cd36、Sdc4），Comp-Sdc4是主要贡献者，介导单核细胞/巨噬细胞到成骨细胞、内皮细胞、MSCs和骨骼肌细胞的信号。FN1通路中，单核细胞/巨噬细胞同样为主要发送者、接收者和影响者，成骨细胞主要接收；识别出Fn1-Sdc4和Fn1-Cd44配对，介导单核细胞/巨噬细胞到成骨细胞、内皮细胞、MSCs、红系细胞和骨骼肌细胞的信号，并伴有单核细胞/巨噬细胞内自分泌信号。
TENASCIN和VEGF信号通路中调节骨骼肌细胞功能的L-R互作的作用
在TENASCIN通路中，骨骼肌细胞是主要影响者和中度发送者/接收者，内皮细胞为关键发送者、接收者、介导者和影响者。识别出Tnxb-Sdc4配对，介导骨骼肌细胞与内皮细胞互作及各自向红系细胞、MSCs、单核细胞/巨噬细胞、髓系细胞和成骨细胞的外向信号。在VEGF通路中，骨骼肌细胞为强发送者和影响者，内皮细胞为 dominant 接收者和影响者；Vegfa-Vegfr1介导骨骼肌细胞到内皮细胞信号，Vegfa-Vegfr2介导骨骼肌细胞到髓系细胞信号。
骨-肌串扰的L-R模式
研究人员聚焦于骨骼肌细胞与骨/骨髓富集细胞群之间的L-R配对。除前述配对外，还包括COLLAGEN中的Col1a2-Cd44和Col4a1-Cd44（肌到红系/髓系）、Col4a1-Sdc4（肌到成骨细胞），以及ADGRG中的Col3a1-Adgrg1（肌到髓系）。COMET多重免疫染色验证了骨-肌界面处成骨细胞（Runx2+）与骨骼肌细胞（Mylpf+）通过Col1a1-Sdc4、Col4a1-Sdc4和Tnxb-Sdc4配对的共定位，以及肌肉内通过Tnxb-Sdc4的互作。
利用独立的小鼠和人类骨scRNA-seq数据集对L-R图谱进行部分验证
利用小鼠骨scRNA-seq数据集（4只雄性小鼠），研究人员观察到复杂的细胞互作网络，10/13个ST识别的通路被复现，COLLAGEN、THBS、SPP1、FN1中的多数L-R配对一致，如Col1a1-Sdc4、Col1a2-Sdc4、Col1a2-Cd44等，并观察到上下文特异性差异。利用人股骨头scRNA-seq数据集（3例），13/13个通路均被复现，多数L-R配对一致。特别在人数据中观察到MSC/成骨细胞到脂肪细胞通过COL1A1/1A2/6A1/6A2/6A3-SDC1、THBS1-SDC1、FN1-SDC1、TNC-SDC1等配对的互作，提示在衰老或骨关节炎条件下骨髓脂肪生成的潜在调控。
讨论与结论总结：
研究人员通过整合空间转录组学与计算反卷积，提供了小鼠股骨及邻近骨骼肌中细胞间互作的空间解析全转录组图谱，揭示了维持组织稳态和骨-肌串扰的复杂细胞通讯网络。研究表明该技术适用于骨及骨骼肌复杂组织，并识别出由成骨细胞、单核细胞/巨噬细胞、骨骼肌细胞和内皮细胞协调的互作，其中特定信号通路（如骨骼肌的TENASCIN和VEGF，单核细胞/巨噬细胞的THBS和FN1，成骨细胞的COLLAGEN和SPP1）作为关键介质。L-R配对分析进一步阐释了其功能角色，如COLLAGEN维持结构完整性，SPP1参与骨重塑和肌肉再生，THBS和FN1调节骨重塑和ECM组织，VEGF促进血管生成，TENASCIN支持ECM重塑和骨-肌串扰。这些通路失调与肌肉骨骼疾病相关。多重免疫染色及跨平台/scRNA-seq验证支持了推断网络的稳健性和生物学相关性。尽管研究存在如骨制备中可能部分脱离、成骨细胞因矿化基质内嵌而信号弱、Visium缺乏单细胞分辨率、单一年轻健康雄性小鼠静态快照等局限，该工作仍为理解骨-肌分子串扰机制提供了基础地图，并为未来肌肉骨骼疾病研究及治疗靶点探索奠定了基础。
