《Microbial Pathogenesis》：Antimicrobial Photodynamic Inactivation of Pseudomonas aeruginosa Biofilms by a Multifunctional Triple Combination of Natural Photosensitisers, Gentamicin, and Colistin
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光动力抗菌灭活（antimicrobial photodynamic inactivation, aPDI）是针对慢性伤口感染尤其是生物膜相关感染的一种极具前景的治疗策略，然而其对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜的灭活效能受限
光动力抗菌灭活（antimicrobial photodynamic inactivation, aPDI）是针对慢性伤口感染尤其是生物膜相关感染的一种极具前景的治疗策略，然而其对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜的灭活效能受限于光敏剂及光线在生物膜基质中的穿透能力不足。本研究首次探索将亚抑菌浓度多黏菌素（colistin, Col）与黄连素/姜黄素（berberine/curcumin, Ber/Cur）及庆大霉素（gentamicin, Gen）联用，以增强aPDI对铜绿假单胞菌生物膜（含一株源自糖尿病足溃疡的临床分离株）的杀灭作用。研究人员采用流式细胞术结合碘化丙啶染色评估Col对细菌细胞膜完整性的影响，通过棋盘法测定Ber/Cur?Gen?Col的协同浓度，并在蓝光（420?nm，30?mW/cm2，10?min）照射下分别开展生物膜形成抑制与已建立生物膜的清除实验。针对成熟生物膜，研究设定每24?h一次、共一至三次的照射周期，并在48?h及72?h评估其再生情况。生物膜的生物量、代谢活性及可培养性分别通过结晶紫染色、刃天青法及菌落形成单位（colony?forming units, CFU）计数进行定量。作用机制研究则借助荧光光谱、显微成像及光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）分析活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成、膜破坏及生物膜结构变化。结果显示，亚抑菌浓度Col可使约30%的细胞膜完整性下降，从而显著提升Ber/Cur?Gen的抗菌效果。经光激活的Ber/Cur?Gen?Col组合可抑制超过90%的生物膜形成（生物量与代谢活性均降低90%以上，CFU减少6个对数级）；对已形成的生物膜，该组合可实现7个对数级的CFU下降及90%的生物量与代谢活性削减。三次照射周期可将抑制效果维持至72?h。其中Ber?Gen?Col表现最优，凸显了亚抑菌浓度Col在增强aPDI效能方面的协同潜力，为管理顽固性伤口感染提供了新策略。
本研究发表于《Microbial Pathogenesis》，针对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜引起的慢性伤口感染耐药难题展开。铜绿假单胞菌是慢性伤口中第二常见的病原体，其复杂的生物膜结构、外排泵及抗氧化防御体系导致传统抗生素疗效显著下降。光动力抗菌灭活（antimicrobial photodynamic inactivation, aPDI）作为一种非抗生素依赖型技术，通过光敏剂（photosensitiser, PS）在光照下产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）破坏细菌多种组分，理论上不易诱导耐药。然而，铜绿假单胞菌生物膜致密的细胞外聚合物基质（extracellular polymeric substance, EPS）阻碍PS与光的渗透，限制了aPDI的实际效果。因此，研究人员提出将天然植物源光敏剂黄连素（berberine, Ber）、姜黄素（curcumin, Cur）与传统抗生素庆大霉素（gentamicin, Gen）、膜破坏剂多黏菌素（colistin, Col）联合，在蓝光激发下形成三重协同策略，旨在提高对临床耐药株尤其是糖尿病足溃疡来源菌株的生物膜防控能力。
关键技术方法方面，研究选用两株铜绿假单胞菌——标准菌株ATCC?10145与一株来自葡萄牙Trás?os?Montes e Alto Douro中心医院糖尿病足溃疡患者的临床分离株MJMC568?A。采用微量肉汤稀释法测定各化合物的单独及联合最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）与最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）。通过生长曲线拟合Gompertz模型筛选不影响细菌生长的亚抑菌浓度Col，并以流式细胞术检测其对膜完整性的影响。利用二维及三维棋盘法评估双重及三重组合的协同效应，并计算分数抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index, FICI）。aPDI处理采用420?nm蓝光LED（30?mW/cm2，10?min），分别在单一及多次照射周期下进行生物膜预防与清除实验。生物膜特性通过结晶紫染色（生物量）、刃天青还原法（代谢活性）及CFU计数（可培养性）评估。作用机制层面，使用光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）分析生物膜厚度与粗糙度，DCF?DA探针检测ROS生成，SYTO9/碘化丙啶（propidium iodide, PI）活/死染色结合荧光显微镜与流式细胞术评估膜完整性及是否存在活的非可培养状态（viable but non?culturable, VBNC）细胞。
研究结果部分，首先在耐药性谱与抗菌药物、植物化学成分及双重组合的抗菌活性中，研究人员发现两株菌均对Gen耐药，但对Col敏感；Ber与Cur单独使用MIC高于400?μg/mL且无显著杀菌作用；Ber?Gen与Cur?Gen双重组合未表现出协同效应，仅呈相加或无关作用。随后在三重组合对铜绿假单胞菌菌株的抗生物膜活性中，亚抑菌浓度Col（ATCC?10145为4?μg/mL，MJMC568?A为2?μg/mL）可在不抑制生长的前提下使膜完整性下降约30%。加入Col后，三重组合对生物膜形成的最小抑制浓度（biofilm prevention minimum inhibitory concentration, BPMIC）与最小杀菌浓度（biofilm prevention minimum bactericidal concentration, BPMBC）均显著降低，最高降幅达32倍。在光激活三重组合对铜绿假单胞菌生物膜形成的预防作用中，单次蓝光照射即可使两株菌的生物膜生物量、代谢活性降低90%以上，并使可培养菌数下降约6?log?CFU/cm2；非光照组仅能降低生物量与代谢活性，无法完全消除可培养菌。在单周期与多周期照射下三重组合对铜绿假单胞菌生物膜的清除作用中，对已形成的24?h生物膜，光激活三重组合可减少7?log?CFU/cm2，并去除90%的生物量与代谢活性；多周期照射可持续抑制再生，至72?h仍保持显著的抑制效果。其中Ber?Gen?Col在三周期内对临床株MJMC568?A实现了持续的可培养性完全抑制。在多周期照射后三重组合的抗生物膜作用机制中，OCT显示处理组生物膜厚度由对照的34–74?μm降至4–11?μm，粗糙度显著下降；ROS检测表明光激活组合在首轮照射即可产生高于过氧化氢阳性对照的ROS水平，但随照射次数增加ROS生成下降；膜完整性检测显示多重照射后临床株的膜损伤接近98%，但仍存在少量具完整膜的绿色荧光细胞，提示VBNC细胞的存在。
讨论与结论部分，研究人员指出铜绿假单胞菌的抗氧化酶系、胞外色素及DNA修复机制共同削弱aPDI的ROS杀伤作用，而EPS屏障与深层缺氧进一步限制光敏剂渗透。将Col作为膜通透性增强剂引入aPDI体系，可利用其破坏外膜LPS与磷脂双分子层的作用，促进Ber、Cur与Gen进入菌体。蓝光激活下，Ber与Cur产生ROS引发脂质过氧化与蛋白氧化，Gen抑制核糖体蛋白合成，多靶点协同显著提高杀菌效率。尽管三次照射未能彻底清除所有VBNC细胞，但该策略已在标准实验室条件下实现对耐药株生物膜的长期抑制，为慢性伤口感染的局部治疗提供了新思路。研究人员强调，未来需在模拟伤口微环境（低氧、营养受限、酸性pH）的体外及离体模型中验证其效能，并优化光敏剂的局部给药剂型以提升临床转化潜力。
