《Microbial Pathogenesis》：Oil-in-water nanoemulsification of peppermint oil enhances its antibacterial and antibiofilm activity
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鲁比娜·迪曼（Rubina Dhiman）| 哈普里特·考尔（Harpreet Kaur）| 安昌尔·塔库尔（Anchal Thakur）| 普罗比尔·库马尔·帕尔（Probir Kumar Pal）| 苏德什·库马尔·亚达夫（Sudesh Kumar Yadav）| 阿米塔巴哈
鲁比娜·迪曼（Rubina Dhiman）| 哈普里特·考尔（Harpreet Kaur）| 安昌尔·塔库尔（Anchal Thakur）| 普罗比尔·库马尔·帕尔（Probir Kumar Pal）| 苏德什·库马尔·亚达夫（Sudesh Kumar Yadav）| 阿米塔巴哈·阿查里亚（Amitabha Acharya）
印度帕兰普尔（Palampur），H.P. 176061，CSIR-喜马拉雅生物资源技术研究所（CSIR-Institute of Himalayan Bioresource Technology），发酵与植物农业技术部门（Fermentation and Phytofarming Technology Division），纳米生物学实验室（Nanobiology Laboratory）
摘要
薄荷精油（Peppermint Essential Oil，PEO）具有广泛的抗菌活性，但其水溶性差、挥发性高且物理化学稳定性有限。为克服这些缺点，研究人员使用Brij?58和Span?80表面活性剂，并通过优化超声技术制备了油包水型薄荷精油纳米乳液（PEONE），成功制备出粒径约为40±9纳米的球形液滴。该乳液在28天内保持稳定，几乎没有发生凝聚现象，Ostwald熟化现象也很轻微，乳化指数仅为1.42–2%。与纯PEO相比，PEONE的抗菌活性显著增强：对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的最低抑菌浓度（MIC50）约为18.22 μL/mL，对大肠杆菌（Escherichia coli）的最低抑菌浓度约为35.55 μL/mL，分别相当于纯PEO的2.4倍和3.3倍。PEONE还表现出较强的抗生物膜能力，能够有效清除成熟生物膜（对金黄色葡萄球菌的MBEC50约为333 μL/mL，对大肠杆菌的MBEC50约为300.7 μL/mL）。在实际应用中，PEONE喷雾可减少表面细菌负荷（对金黄色葡萄球菌减少约83%，对大肠杆菌减少约48%），效果优于市售消毒剂，并通过增加表面亲水性（接触角从约80°降至约50°）降低了细菌附着。这些结果表明，PEONE是一种适用于卫生和生物医学表面/设备应用的优质植物基抗菌制剂。
引言
全球细菌感染负担日益加重，尤其是与抗菌素耐药性相关的感染，这构成了重大的公共卫生挑战，需要采取协调一致的应对策略[1, 2]。根据世界卫生组织的数据，目前六分之一的实验室确诊的细菌感染对常用抗生素具有耐药性，2018年至2023年间，超过40%的病原体-抗生素组合的耐药性有所上升，许多地区的年增长率为5–15%[3]。在美国，疾病控制与预防中心估计每年有超过280万例抗生素耐药性感染和35,000例相关死亡；欧洲的监测数据显示，大肠杆菌（Escherichia coli）和克雷伯菌（Klebsiella）等关键病原体的耐药性也在增加[4]。抗生素的滥用和过度使用加速了耐药菌株的出现和传播[5]。因此，曾经可以治疗的常见感染变得越来越难以治疗，导致病程延长、医疗费用增加以及死亡风险上升[6]。传统抗生素通常通过靶向一种关键的细菌代谢途径来发挥作用[7]。例如，β-内酰胺类抗生素（如青霉素和头孢菌素）通过抑制青霉素结合蛋白（PBP）的转肽酶活性来干扰肽聚糖的合成，从而破坏细胞壁的完整性，导致细菌裂解[8]。同样，在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中，万古霉素通过与肽聚糖前体的D-Ala-D-Ala末端结合，阻断转糖基化和转肽反应，导致细胞壁不稳定，最终使细菌死亡[9]。然而，越来越多的菌株对这些传统抗生素的敏感性降低，这凸显了开发替代抗菌策略的迫切需求[10]。因此，人们越来越关注具有多重作用机制的替代抗菌策略，以降低耐药性发展的可能性。在抗菌研究中，植物次生代谢产物是一个有前景的方向，它们具有多种生态功能，包括抵御食草动物、病原体和微生物[11]。其中，精油（Essential Oils，EOs）尤为重要。这些挥发性芳香化合物可从植物的叶子、花朵、树皮和根部提取，不仅赋予植物特有的香气，还是植物抵御生物和非生物环境压力的第一道防线[12]。尽管精油具有明确的抗菌潜力，但其实际应用仍面临诸多限制：疏水性、高挥发性、强烈气味以及易受光降解和热不稳定性的影响，这些都降低了其效果和保质期。纳米技术为解决这些问题提供了有效途径[13, 14]。在本研究中，我们使用了薄荷（Mentha piperita）精油，它是水薄荷（Mentha aquatica L.）和留兰香（Mentha spicata L.）的杂交品种。薄荷精油因其丰富的植物化学成分而备受关注，其中含有薄荷醇（29-48%）、薄荷酮（20-31%）和乙酸薄荷酯（3-10%）[15]。这些成分具有显著的抗菌、抗氧化和抗炎作用，使薄荷精油成为抗菌干预的理想候选物质[16]。然而，由于其高挥发性、低水溶性和在热、光和氧气等环境压力下的化学不稳定性，直接使用薄荷精油受到限制[17, 18]。为克服这些限制，多项研究探索了薄荷精油纳米乳液（PEONE）的制备方法。虽然这些方法提高了精油的分散性和抗菌活性，但现有的薄荷纳米乳液仍存在一些缺点：液滴尺寸较大且不均匀，多分散性指数较高，长期稳定性有限，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌成熟生物膜的抗菌效果也较弱[19, 20]。此外，许多系统依赖高能耗或多步骤均质化技术，这影响了规模化和批次间重复性的实现。基于这些不足，我们假设更好地控制液滴尺寸、提高单分散性和增强界面稳定性是提高薄荷精油纳米乳液物理化学稳定性和生物效果的关键。因此，我们采用超声辅助技术，结合非离子表面活性剂Brij?58/Span?80，成功制备了优化后的PEONE纳米乳液。纳米乳液是一种由两种不相溶液体组成的胶体分散体系，其液滴尺寸在纳米范围内，能够提高精油的水溶性，降低挥发性，并保护包裹的生物活性成分免受氧化和光降解的影响[21]。我们的配方策略基于以下理念：粒径小于100纳米、多分散性低的液滴可在水环境中均匀分散，增强与细菌膜的接触，提高对生物膜基质的渗透性，从而增强抗菌和抗生物膜效果。实验结果证实，PEONE的较小液滴尺寸有助于其与细菌表面的相互作用，改善了生物活性成分的分布和稳定性。总体而言，这一设计旨在克服以往薄荷纳米乳液的局限性，提升薄荷精油作为抗菌和抗生物膜剂的效能，针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的效果已在本文中进行了系统评估。
章节摘录
材料与方法
薄荷精油（PEO）由印度帕兰普尔（Palampur）的CSIR-IHBT提供。Brij?58和Span?80购自印度Merck Sigma-Aldrich公司。抗菌实验使用大肠杆菌（MTCC 1650）和金黄色葡萄球菌（MTCC 3160）菌株进行，实验批准号为IHBT/IBSC/20/N13（IBKP ID: TAI: C100351），分别在Muller Hinton肉汤（MHB）和营养肉汤（NB）培养基中培养，短期储存时温度控制在4°C。实验中还使用了二甲基亚砜（DMSO）。
PEONE制备的原理
细菌性传染病仍然是全球性的公共卫生问题。耐药菌株的出现加剧了这一挑战，因此需要开发创新的抗菌策略。利用天然化合物（如薄荷精油）的抗菌特性是开发新型抗菌策略的有效途径。虽然薄荷精油具有基本的抗菌作用，但直接使用存在局限性
当前纳米乳化技术的优势
以往关于薄荷精油纳米乳液的研究通常报告较大的液滴尺寸，平均直径约为101–200纳米，某些情况下甚至高达817.5纳米（参考文献S8，表S2）[19, 32]。这些制剂的多分散性较高，表明尺寸分布较广，纳米级均匀性控制较差[33]。从配方角度来看，大多数报道的薄荷精油纳米乳液是通过高速均质化方法制备的
结论
本研究成功制备并优化了PEONE，使其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抗菌和抗生物膜效果。通过纳米乳液技术克服了精油的固有局限性，PEONE表现出更好的物理化学稳定性和更强的抗菌效果。分析表明，PEONE对金黄色葡萄球菌的作用迅速且高效，而对大肠杆菌的作用虽然较慢但同样有效
作者贡献声明
鲁比娜·迪曼（Rubina Dhiman）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证和实验设计。哈普里特·考尔（Harpreet Kaur）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法验证和实验设计。安昌尔·塔库尔（Anchal Thakur）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法验证和实验设计。普罗比尔·库马尔·帕尔（Probir Kumar Pal）：负责撰写、审稿与编辑、资源协调、资金筹集和数据分析。苏德什·库马尔·亚达夫（Sudesh Kumar Yadav）：负责撰写、审稿与编辑、数据验证和结果整理。
作者声明以下可能构成利益冲突的财务关系/个人关系：阿米塔巴哈·阿查里亚（Amitabha Acharya）获得了印度科技部生物技术部的财政支持。她拥有专利“含有薄荷精油纳米乳液和纤维素纳米晶体的抗菌霜制剂及其制备方法”（专利申请号202511008627），该专利正在审批中。
作者感谢CSIR-IHBT提供的基础设施支持。AA和PKP感谢DBT（GAP-0295）的财政支持。RD、HK和AT分别感谢DBT（GAP-0295）和UGC（23161012765）及DST（IF240059）的资助。本研究已申请专利（专利申请号202511008627），申请日期为2025年1月30日。本手稿的CSIR-IHBT编号为5581。
