《Journal of Pineal Research》：Melatonin Counteracts Mechanical Unloading-Induced Bone Loss Through YTHDF3-Mediated m6A Modification of Dapk2 mRNA
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失用性骨质疏松由长期机械卸载引发，以骨量丢失与骨折风险升高为核心特征。尽管褪黑素已被证实具有促骨合成活性，但其在机械卸载情境下的作用机制尚未明确。研究人员发现，褪黑素可促进成骨分化并抑制成骨细胞凋亡，从而减轻后肢卸载（HLU）小鼠的卸载诱导性骨质疏松性骨丢失。
失用性骨质疏松由长期机械卸载引发，以骨量丢失与骨折风险升高为核心特征。尽管褪黑素已被证实具有促骨合成活性，但其在机械卸载情境下的作用机制尚未明确。研究人员发现，褪黑素可促进成骨分化并抑制成骨细胞凋亡，从而减轻后肢卸载（HLU）小鼠的卸载诱导性骨质疏松性骨丢失。进一步研究显示，机械卸载会抑制成骨细胞及骨组织中YTHDF3的表达，而褪黑素给药可有效逆转这一效应。功能层面，YTHDF3可增强成骨细胞分化与基质矿化能力，同时抑制凋亡发生。分子机制层面，YTHDF3可直接识别带有m6A修饰的Dapk2转录本并促进其降解。DAPK2被鉴定为成骨分化与存活的负调控因子。遗传学分析证实，褪黑素对DAPK2的抑制作用及对成骨细胞的功能挽救均依赖于YTHDF3。综上，本研究阐明了一条褪黑素/YTHDF3/DAPK2保护性轴，该轴通过Dapk2的转录后调控抵御卸载诱导的骨退变，为失用性骨质疏松的机制研究与治疗策略开发提供了新的视角。
该研究针对长期机械卸载导致的失用性骨质疏松临床难题展开，此类疾病常见于长期卧床患者及航天员群体，现有治疗手段存在疗效有限、不良反应明显、患者依从性差等局限。成骨细胞功能受损是骨形成减少的核心原因，但机械卸载调控成骨的具体分子机制尚未完全阐明。褪黑素作为松果体分泌的吲哚胺类激素，已被证实具有调节骨代谢的作用，但其对抗机械卸载性骨丢失的表观遗传机制仍待探索。研究人员通过体外二维回转模拟卸载与体内小鼠后肢卸载模型，结合m6A修饰调控网络分析，首次揭示了褪黑素通过YTHDF3介导的Dapk2 mRNA m6A修饰调控轴保护骨稳态的新机制，相关成果发表于《Journal of Pineal Research》。
研究采用的关键技术方法包括：使用MC3T3-E1小鼠前成骨细胞系与6月龄雄性C57BL/6J小鼠构建体外二维回转与体内后肢卸载模型；通过慢病毒介导的基因敲低与过表达技术调控YTHDF3与DAPK2表达；采用(DSS)6-脂质体纳米递送系统实现骨靶向Ythdf3基因递送；运用微量计算机断层扫描（Micro-CT）评估骨微结构与骨密度；通过RNA免疫沉淀（RIP）与双荧光素酶报告实验验证YTHDF3与Dapk2 mRNA的直接结合及m6A修饰依赖性调控关系。
研究结果分为以下部分：
3.1 褪黑素改善卸载诱导的成骨细胞功能障碍：体外二维回转模拟卸载显著抑制成骨标志物ALP、COL1A1、OCN、RUNX2的表达，促进成骨细胞凋亡，而100 nM褪黑素处理可逆转上述效应，恢复成骨分化能力与抗凋亡平衡。
3.2 褪黑素维持后肢卸载小鼠的骨量、结构与力学强度：体内实验显示，20 mg/kg褪黑素隔日腹腔注射可显著增加卸载小鼠骨钙素阳性成骨细胞数量，降低凋亡细胞比例，改善骨小梁稀疏与结构断裂，提升骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N），降低骨小梁分离度（Tb.Sp），同时提高矿化沉积率（MAR）与三点弯曲试验中的最大载荷、刚度、弹性模量等生物力学性能。
3.3 褪黑素通过MT2受体恢复机械卸载下YTHDF3的表达：筛选发现机械卸载特异性下调m6A阅读蛋白YTHDF3，褪黑素可通过MT2受体（而非MT1受体）逆转卸载诱导的YTHDF3表达抑制，且该效应可被褪黑素受体拮抗剂Luzindole阻断。
3.4 YTHDF3通过增强分化矿化与抑制凋亡调控成骨进程：YTHDF3表达随成骨分化进程逐渐升高；敲低YTHDF3显著降低成骨标志物表达与基质矿化能力，促进凋亡，而过表达YTHDF3则产生相反效应，证实其为成骨稳态的正调控因子。
3.5 褪黑素通过YTHDF3依赖性机制缓解卸载诱导的成骨功能障碍：过表达YTHDF3可部分挽救卸载导致的成骨抑制与凋亡升高；而敲低YTHDF3则显著削弱褪黑素的骨保护作用，表明YTHDF3是褪黑素发挥效应的关键介质。
3.6 骨靶向Ythdf3基因递送对失用性骨质疏松具有部分治疗效果：(DSS)6-脂质体递送Ythdf3至骨组织可有效提升卸载小鼠的成骨细胞数量、骨密度与生物力学性能，减少凋亡与破骨细胞活性，验证了YTHDF3的治疗潜力。
3.7 YTHDF3通过结合Dapk2 mRNA的特定m6A基序调控其表达：转录组测序与验证实验显示，YTHDF3可直接结合Dapk2 mRNA的m6A修饰位点，促进其降解；敲低YTHDF3延长Dapk2 mRNA半衰期，而褪黑素加速Dapk2降解的过程依赖YTHDF3。
3.8 褪黑素通过YTHDF3/DAPK2通路增强卸载下的成骨分化并抑制凋亡：DAPK2是成骨分化与存活的负调控因子；共敲低Ythdf3与Dapk2可逆转YTHDF3缺失导致的成骨抑制与凋亡升高；而过表达DAPK2则抵消褪黑素的骨保护作用，证实DAPK2是YTHDF3的关键下游效应分子。
讨论部分指出，该研究首次将m6A表观转录调控与褪黑素的骨保护作用相联系，明确了YTHDF3在机械卸载性骨丢失中的核心地位。既往研究多聚焦于m6A甲基化酶（writer）与去甲基化酶（eraser），该研究补充了阅读蛋白（reader）在骨代谢中的调控作用。DAPK2作为mTORC1通路的负调控因子，可能通过抑制mTORC1-Raptor信号阻断Runx2转录激活，进而抑制成骨分化并诱导凋亡，这为后续机制研究提供了方向。研究结论为：褪黑素通过上调YTHDF3表达，促进m6A修饰的Dapk2 mRNA降解，进而抑制DAPK2介导的成骨抑制与凋亡，最终减轻机械卸载诱导的骨丢失，该褪黑素/YTHDF3/DAPK2轴为失用性骨质疏松提供了新的治疗靶点。
