《Molecular & Cellular Proteomics》：A platform for high-throughput and ultrasensitive immunopeptidomics
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基于质谱（MS）的免疫肽组学是一种非靶向解析主要组织相容性复合体（MHC）呈递肽的有力手段，可指导疫苗抗原与免疫治疗靶点的筛选。第一代免疫肽组学工作流程需处理数亿个细胞，操作繁琐且耗时较长。近年来的方法多聚焦于提升灵敏度或通量，但鲜有同时兼顾两者。研究人员开发
基于质谱（MS）的免疫肽组学是一种非靶向解析主要组织相容性复合体（MHC）呈递肽的有力手段，可指导疫苗抗原与免疫治疗靶点的筛选。第一代免疫肽组学工作流程需处理数亿个细胞，操作繁琐且耗时较长。近年来的方法多聚焦于提升灵敏度或通量，但鲜有同时兼顾两者。研究人员开发了一种半自动化免疫肽组学平台，通过在96孔正压装置中优化MHC I类和II类肽的分离条件，实现了高灵敏度与高通量的结合。100 μL小体积裂解可高效完成MHC捕获，并使用适配孔径的96孔滤板实现自动化洗涤、洗脱及C18纯化。仅分析1600万细胞中25%的洗脱产物，该流程即可在timsTOF SCP质谱仪DDA-PASEF模式下鉴定超过13,500条MHC I肽和6,000条MHC II肽。在灵敏度极限测试中，研究人员从仅20,000个JY细胞中鉴定出多达1,000条MHC I肽，其中包含数百条预测结合肽。为验证平台的定量生物学发现性能，研究人员在感染单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）或卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）的U937巨噬细胞中，鉴定出已知及新型细菌免疫肽。综上，该优化的免疫肽组学平台能够以高通量方式从低起始量样本中稳健检测免疫肽，适用于样本量受限的生物学应用场景。
该研究针对免疫肽组学样本制备长期存在的瓶颈问题展开。传统基于质谱（MS）的免疫肽组学依赖大量细胞输入，且手动免疫沉淀（IP）步骤繁琐、重现性差，限制了其在临床稀缺样本中的应用。现有方法往往单独优化灵敏度或通量，难以同时满足低起始量和高通量分析的需求。为此，研究人员开发了集成化的半自动化工作流程，旨在突破样本量与通量之间的制约。
关键技术方法包括：采用正压驱动96孔滤板系统，实现MHC I类和II类的连续捕获；优化100 μL小体积裂解条件以提升蛋白浓度；使用timsTOF SCP质谱仪结合DDA-PASEF（数据依赖性采集-平行累积串行碎裂）模式进行高灵敏度检测；数据分析整合四种搜索引擎并进行数据驱动的重评分以提高鉴定置信度；针对病原体感染模型，构建U937巨噬细胞感染单核细胞增生李斯特菌及BCG的样本队列。
研究结果如下：
一个用于高通量免疫肽组学的自动化工作流程
研究人员通过将细胞裂解体积缩减至100 μL，并在0.7 μm孔径的96孔滤板上进行静态孵育，显著提高了MHC捕获效率。该流程在Tecan Resolvex? A200正压处理器上实现了从裂解、捕获到洗脱的全自动化。测试表明，使用1600万JY细胞输入时，单次进样可鉴定数千条高质量免疫肽，且MHC I类肽中81%为预测结合肽，序列 motif 符合HLA特征。随着细胞输入量降低，鉴定到的肽段数量呈梯度下降，但在50万细胞水平仍能获得良好的重现性，且强结合肽的比例随输入量减少而升高。
迈向超灵敏免疫肽组学
在极低输入测试中，研究人员从仅20,000个JY细胞中成功鉴定出1,244条肽段，其中包括292条预测的MHC I类结合肽，且序列 motif 与高输入样本一致。多引擎重评分策略显著提升了低丰度肽段的检出率。强度分析显示，高丰度免疫肽更易在低输入样本中保持稳定检出，而极低输入下非结合肽的增加主要源于微量制备过程中的背景污染。
感染细胞呈递的细菌免疫肽检测
将该平台应用于病原体研究，研究人员在1600万感染单核细胞增生李斯特菌的U937细胞中鉴定出50条高置信度细菌肽，覆盖35种细菌蛋白，包括已报道的免疫显性抗原如溶血素（hly/LLO）和OppA。在BCG感染模型中，同样鉴定出41条细菌肽，对应32种蛋白，其中热休克蛋白GroEL2及hupB等抗原与既往高输入量研究结果吻合，验证了该平台在低样本量下的抗原发现能力。
BCG感染诱导宿主免疫肽组的定量重塑
定量分析显示，BCG感染导致宿主免疫肽组发生显著改变。研究人员鉴定出1,301条差异调控的宿主肽段。基因集富集分析表明，感染上调的肽段富集于核糖体蛋白及免疫相关通路，特别是IL-17信号通路和FcγR介导的吞噬作用。例如，促炎因子IL-1β在感染细胞中的呈递显著增强，反映了细菌感染引发的免疫应答重编程。
在讨论部分，研究人员指出该平台的核心优势在于将小体积裂解与正压自动化相结合，解决了传统大体积裂解导致的低效率问题。相比以往的多孔板方法，该流程减少了样本转移损失，提升了低丰度肽的检测稳定性。尽管微流控技术可进一步微型化，但其通量受限且设备复杂。研究人员强调，该平台在保持试剂恒定的前提下，平衡了灵敏度与通量，特别适用于生物安全等级高、样本获取受限的病原体研究。未来的优化方向可能包括引入磁珠分选及生物素化抗体以降低背景噪音，并兼容DIA-PASEF等新型质谱采集模式。该工作证明了低起始量免疫肽组学在揭示宿主-病原体互作机制及加速疫苗靶点发现方面的巨大潜力。
