《Molecular & Cellular Proteomics》：Proteomic Analysis on Human Islets Suggests Nucleocytoplasmic Transport as a Mechanism of PERK Attenuation Effects in Diabetes
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背景：既往研究表明，胰腺内质网激酶（pancreatic endoplasmic reticulum kinase, PERK）活性部分下调可在暴露于葡萄糖脂毒性（glucolipotoxicity, GLT）的人胰岛中恢复胰岛素含量，并在2型糖尿病小鼠模型中
背景：既往研究表明，胰腺内质网激酶（pancreatic endoplasmic reticulum kinase, PERK）活性部分下调可在暴露于葡萄糖脂毒性（glucolipotoxicity, GLT）的人胰岛中恢复胰岛素含量，并在2型糖尿病小鼠模型中改善胰岛素分泌及降糖效应。本研究旨在阐明PERK抑制增强β细胞功能的分子机制。方法：研究人员将非糖尿病活体供者分离的人胰岛分为三组：对照组、模拟糖尿病条件的GLT组、GLT联合PERK抑制剂（PERKi, GSK2606414）处理24小时组，对上述样本开展蛋白质组学分析。采用生物信息学方法分析受GLT调控并被PERKi逆转的差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs），并通过蛋白质免疫印迹、逆转录实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）及免疫细胞化学实验进行验证。结果：合并7名参与者的9份胰岛样本后，在三组共5513种可定量蛋白中鉴定出161个DEPs。针对其中42个被GLT下调、被PERKi上调的蛋白子集开展的基因本体论（gene ontology, GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析显示，核质运输（nucleocytoplasmic transport, NCT）为核心通路，涉及XPO4、KPNA4、NUP43、NUP58等基因。来自4名独立供者胰岛的重复蛋白质组学分析进一步支持NCT尤其是XPO4的参与。基于此，研究人员检测了代表性β细胞转录因子PDX1（pancreatic and duodenal homeobox 1）和FOXO1（forkhead box O1）的NCT情况：PERKi显著增加了GLT条件下两者的核定位（均p < 0.05），同时其靶基因如FBXW5的表达升高，提示PERKi介导的NCT调控可能增强PDX1与FOXO1的功能活性。结论：蛋白质组学分析表明，PERKi可调节代谢应激下人胰岛的NCT，进而通过调控相关转录因子促进β细胞功能恢复。该发现提示低剂量PERKi除经典未折叠蛋白反应外，还可作为一种糖尿病治疗新策略的作用机制。
本研究发表于《Molecular & Cellular Proteomics》。研究背景方面，慢性高血糖与游离脂肪酸水平升高导致的葡萄糖脂毒性（GLT）是驱动胰岛β细胞功能进行性衰退的关键致病因素。胰腺内质网激酶（PERK）作为内质网膜蛋白，对β细胞发育、胰岛素转运及存活至关重要：PERK完全缺失会导致小鼠胰腺萎缩、胰岛素缺乏及人类新生儿糖尿病，但部分降低PERK活性却可产生有益效应——杂合子Perk敲除小鼠及低剂量PERK抑制剂（PERKi）处理均可提升胰岛素含量与分泌，改善高血糖。然而，PERKi发挥保护作用的机制尚未完全明确，其有效剂量远低于抑制未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）所需的浓度，且除已发现的ATG7依赖性自噬恢复作用外，仍存在未知信号通路。因此，研究人员通过开展人胰岛蛋白质组学分析，探索PERK抑制改善β细胞功能的全新机制。
本研究采用的核心技术方法包括：以2021至2025年在首尔国立大学医院接受胰腺手术的非糖尿病局部病变患者为供者来源，分离人胰岛并建立GLT与PERKi处理的体外模型；先后采用串联质谱标签（tandem mass tag, TMT）与数据非依赖采集质谱（data-independent acquisition mass spectrometry, DIA-MS）两种互补的蛋白质组学平台开展分析，前者合并7名供者的9份样本，后者纳入4名独立供者的样本以验证发现；通过生物信息学工具对差异表达蛋白（DEPs）开展GO与KEGG富集分析及蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction, PPI）网络构建；采用蛋白质免疫印迹、qRT-PCR及免疫细胞化学实验对候选通路与分子进行功能验证。
研究结果部分，第一部分为参与者与分离胰岛的特征：共纳入22名非糖尿病手术供者，胰岛分离前无抗癌治疗、糖皮质激素使用史，胰岛冷缺血时间短，分离后经过夜孵育以排除体内病理状态干扰，样本质量符合后续分析要求。第二部分为TMT蛋白质组学特征：共鉴定到5945种蛋白，其中5513种可定量，高丰度蛋白以胰腺特异性表达为主，胰岛素的高表达验证了样本纯度，整体数据集变异主要由少量高丰度蛋白驱动。第三部分为GLT与PERKi调控的DEPs定量分析：ANOVA分析筛选出161个显著变化的DEPs，占可定量蛋白的约3%，基于这些DEPs的主成分分析（principal component analysis, PCA）可清晰区分三组样本，层次聚类将其分为5个簇，其中簇2为GLT上调、PERKi逆转的14个蛋白，簇5为GLT下调、PERKi逆转的42个蛋白。第四部分为功能聚类揭示胞内运输与酶解代谢是PERKi应答的主要反应：GO分析显示簇2富集于营养感知相关的酶活性调控通路，簇5则富集于胞质分裂、蛋白水解及核质运输（NCT）相关条目，包括“蛋白运输”“核孔”“核质载体活性”等，且REVIGO分析显示“蛋白核定位”与“NCT”为核心节点，同时两类簇均提示自噬相关活性，与既往研究一致。第五部分为通路与网络分析确定NCT是PERKi的核心作用机制：KEGG富集分析显示簇5中唯一显著富集的通路为NCT，包含XPO4、KPNA4、NUP43、NUP58四个核心分子，PPI网络分析进一步证实XPO4与NUP43是该通路的关键枢纽。第六部分为独立DIA-MS队列验证关键发现：DIA-MS分析鉴定到2436个显著差异蛋白，簇5同样富集NCT通路，且XPO4的表达模式与TMT队列完全一致，验证了结果的可靠性。第七部分为PERKi对转录因子NCT的调控：功能验证显示，GLT条件下β细胞关键转录因子PDX1发生核质错位、与共定位应激颗粒标记TIA1共定位，PERKi处理可恢复其核质比并提升其靶基因FBXW5的表达，且该效应仅存在于低剂量PERKi，高剂量或结构不同的PERKi无此作用；另一转录因子FOXO1在GLT下核定位升高，低剂量PERKi可进一步增强其核积累，同时恢复胰岛素表达，提示PERKi对NCT的调控具有异质性。
讨论部分总结指出，本研究通过TMT与DIA两种正交质谱平台的互补分析，排除了供者异质性的干扰，首次在人胰岛中证实PERK抑制可通过调控NCT改善GLT诱导的β细胞功能障碍。NCT通路的核心组分包括核孔复合体（nuclear pore complexes, NPCs）的结构蛋白NUP家族及可溶性转运受体KPNA4、XPO4等，PERKi可能通过上调KPNA4促进PDX1等转录因子的核输入，而XPO4作为FOXO1的预测靶基因，可能参与代谢调控的反馈环路。研究同时指出，PERKi对NCT的调控并非局限于单一转录因子，而是可能广泛影响β细胞身份、代谢与应激响应相关的转录网络。尽管研究存在活体供者胰岛产量有限、无法完全排除潜在胰腺病理影响的局限性，但采用的独立队列验证与功能实验仍支持结果的可靠性。最终结论为：PERK抑制通过调控NCT恢复β细胞转录因子功能，是改善糖尿病状态下β细胞功能的新机制，为低剂量PERKi的临床转化提供了分子层面的证据。
