靶向自组装肽递送系统的体内分布与细胞摄取机制：靶向配体的主导作用及自组装基团的调节效应

《Nano Today》：In vivo distribution and cellular uptake mechanism of targeting self-assembling peptide delivery systems: Dominant role of targeting ligands and modulatory effect of self-assembling moieties

陈莉|哈森·比利格|宋静琳|雷婷|何朗志|李志辉|安宏伟|王浩|王云

北京大学公共卫生学院职业与环境健康科学系，北京100191，中国

摘要

将靶向肽与自组装基序结合，形成靶向自组装肽递送系统，为开发用于精准生物医学应用的多功能纳米材料提供了一种有前景的策略。阐明靶向自组装肽在体内的分布和细胞摄取机制对于合理设计药物递送系统至关重要。在本研究中，我们系统评估了一种Cy7标记的HER2靶向自组装肽（即结合肽P3）的生物分布和细胞摄取机制。为了明确每个功能组分的单独作用，我们比较了P3及其功能组分（靶向肽P2和自组装肽P1）以及在健康BALB/c小鼠中的游离Cy7的分布情况。体内成像显示，P1和游离Cy7在全身中的分布相似，荧光强度相当（主要在肺、肝和肾中），血液半衰期较短（P1为0.87小时，Cy7为0.70小时），且细胞摄取量极少。相比之下，P2和P3在靶器官中积累，并且循环时间显著延长（分别为2.31小时和2.70小时）。P2主要在肝脏中积累，而P3主要在肝脏和肾脏中积累。这三种肽在器官分布上没有性别差异。P2和P3的细胞摄取被证实依赖于HER2，通过网格蛋白介导的内吞作用进行，导致在高HER2表达的细胞中内化程度显著更高。本研究表明，靶向结构单元和自组装结构单元共同调节靶向自组装肽递送系统的体内分布，而系统的细胞摄取机制主要由靶向结构单元调控。靶向自组装肽P3在开发和优化HER2靶向肽递送系统方面具有巨大潜力。

引言

开发兼具高生物相容性和精准靶向能力的多功能纳米载体仍是现代纳米医学的基石。在这种背景下，将靶向肽与自组装基序结合，形成靶向自组装肽递送系统，为开发用于精准生物医学应用的多功能纳米材料提供了一种有前景的策略。这些系统利用了肽的固有优势，包括易于合成、结构多样性和良好的生物相容性，同时整合了主动靶向和超分子纳米结构形成的协同功能[1]、[2]、[3]、[4]。这种模块化设计使得这些系统能够在疾病部位更好地积累，并提高细胞内化效率，使其成为药物递送、成像和再生医学的多功能平台。

人表皮生长因子受体2（HER2）是多种恶性肿瘤（包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌和膀胱癌）中过度表达的关键致癌驱动因子，使其成为精准治疗的关键靶点[5]。传统的HER2导向药物，如单克隆抗体曲妥珠单抗和酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼，已成为治疗的基石[6]、[7]、[8]。然而，它们的临床应用常常受到脱靶毒性和特异性不足等问题的限制，这突显了需要具有改进靶向特性的新治疗策略[9]、[10]、[11]、[12]。

基于肽的靶向方法为提高特异性提供了有前景的途径[13]、[14]。肽YCDGFYACYMDV（含有内部二硫键）源自抗HER2抗体，通过特异性结合HER2来体现这一方法[15]、[16]。它不仅在肿瘤部位积累，还对HER2二聚化和下游信号传导产生直接抑制作用[17]。尽管有效，但这类离散肽分子可能面临许多生物制剂的共同问题，包括快速的全身清除和有限的协同药物递送能力。

为了解决这些更广泛的递送挑战，自组装肽递送系统应运而生[18]。例如，肽片段GNNQQNY可以自发组织成具有高载药能力、可调节形态和生物相容性的稳定纳米结构，非常适合控制药物递送[19]、[20]、[21]。因此，将精准靶向元件（如YCDGFYACYMDV）与可编程自组装支架（如GNNQQNY）结合是一种合理的设计策略。由此产生的靶向自组装肽递送系统旨在将分子识别的特异性与纳米级组装体的优异药代动力学和载荷携带优势结合起来。据报道，基于上述两种肽设计的肽-药物结合物（MMAE-PABC-Cit-VaI-OC(CH₂)₃CO-H₃-GNNQQNY-(OEG)₄-YCDGFYACYMDV-NH₂)表现出极高的HER2靶向递送潜力，并在HER2阳性肿瘤中显示出优异的效果[22]。

探索靶向自组装肽递送系统的体内分布和细胞摄取机制，并阐明不同结构单元（如靶向结构单元和自组装结构单元）的具体调控作用，不仅能为优化基于肽的递送系统提供实验证据，还能为开发精准抗肿瘤药物奠定理论基础。在本研究中，我们系统评估了一种Cy7标记的靶向自组装肽（命名为靶向自组装肽P3，Cy7-HHHGNNQQNY-PEG4-YCDGFYACYMDV-NH₂（Cys-Cys桥）的生物分布和细胞摄取机制。为了明确每个功能组分的单独作用，我们比较了P3及其功能组分（靶向肽P2和自组装肽P1）以及在健康BALB/c小鼠中的游离Cy7的分布情况（肽结构见图1A）。通过这种比较方法，我们旨在区分靶向配体的贡献和自组装基序的贡献，从而深入了解每个结构单元如何调控整合递送系统的体内命运和细胞内化。本研究的结果有望为下一代具有精确控制体内行为的基于肽的纳米载体的合理设计提供参考。

章节片段

在透射电子显微镜下观察到，所有三种肽都表现出自组装行为，每种肽都具有独特的纳米结构形态。如图1B-1D所示，制备后立即，所有三种肽都处于球形状态。与HER2蛋白共孵育4小时后，所有三种肽都发生了自组装。自组装肽单元P1形成了相对较厚的纳米纤维（见图1E），这与现有研究结果一致[19]。

讨论

尽管靶向自组装肽递送系统在药物递送和诊断成像方面具有很大潜力，但对其体内生物分布和药代动力学的研究仍然明显不足。此外，不同结构单元如何影响靶向自组装肽递送系统在复杂生理环境中的组织分布、滞留时间和清除途径尚未得到系统研究。阐明这些

结论

本研究表明，靶向自组装肽递送系统的体内分布受靶向结构单元和自组装结构单元的共同调控，而细胞摄取机制主要由靶向结构单元控制。具体而言，自组装肽单元P1在体内分布迅速且清除速度快，半衰期为0.87小时。靶向肽单元P2主要在肝脏中积累，半衰期为

本研究中使用的三种Cy7标记肽分别为P1（自组装肽，Cy7-HHHGNNQQNY）、P2（靶向肽，Cy7-YCDGFYACYMDV-NH2（Cys-Cys桥）和P3（通过它们结合形成的靶向自组装肽，P1-PEG4-P2，Cy7-HHHGNNQQNY-PEG4-YCDGFYACYMDV-NH2（Cys-Cys桥）），均由中国肽有限公司合成并购买。肽结构的示意图见图1A。纯化后，三种肽的纯度

雷婷：研究。何朗志：研究。李志辉：研究。安宏伟：撰写 – 审稿与编辑。王浩：撰写 – 审稿与编辑，项目管理。王云：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，数据管理。陈莉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，研究，正式分析。哈森·比利格：研究，正式分析。宋静琳：研究。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

本工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFA1205703）的支持。