一种可生物降解的纳米助剂使耐药的肺炎克雷伯菌重新对β-内酰胺类抗生素产生敏感性

《Nano Today》：A biodegradable nanoadjuvant resensitizes drug-resistant Klebsiella pneumoniae to β-lactam antibiotics

　　

高英超|王宏宇|薛云|张玉飞|黄思远|钟远汉|胡玉清|王国伟|吴中明|张新格

教育部功能高分子材料重点实验室，天津大学化学学院高分子化学研究所功能高分子材料重点实验室，中国天津300071

摘要

抗生素是目前治疗细菌感染最常用的方法。抗生素耐药性的出现已被认为是对公共卫生的一个新兴威胁。在广泛使用的抗生素中，β-内酰胺类抗生素具有低毒性和优异的临床疗效。β-内酰胺酶通过水解几乎所有β-内酰胺类抗生素来赋予其耐药性。本文报道了一种由麦芽六糖修饰的聚(5-甲基-三甲基亚甲基碳酸酯-苯并氮杂硼杂环)自组装而成的新型抗生素纳米助剂，该助剂可用于对抗β-内酰胺酶的催化活性。这种纳米助剂能够通过特异性识别麦芽糖部分捕获并进入耐药性的K. pneumoniae细菌。助剂表面的苯并氮杂硼杂环通过共价且可逆的结合机制抑制C类β-内酰胺酶的活性，从而在不诱导耐药性的情况下恢复细菌对抗生素的敏感性。作为载体，这种纳米助剂有助于抗生素进入细菌细胞，提高杀菌效率。在用纳米助剂处理后，感染耐药性K. pneumoniae的小鼠肺炎模型中进一步证实了其对β-内酰胺类抗生素的敏感性增强以及炎症反应的减轻。这项工作提供了一种创新的策略，利用多价纳米助剂抑制β-内酰胺酶活性，从而显著提高抗生素的疗效。

引言

抗生素是现代医学的基础，显著降低了儿童死亡率并延长了预期寿命。它们在侵入性手术和化疗等治疗中发挥着关键作用。然而，由于抗菌素耐药性的出现以及抗生素发现的停滞，传染病已成为日益严重的全球健康威胁[1]。β-内酰胺类抗生素作为一类重要的抗生素，因其高效性、安全性和广谱抗菌活性而被广泛使用了几十年[2]、[3]、[4]。这些药物的长期和广泛使用降低了它们对多种细菌菌株的效力，引发了对其未来疗效的严重担忧[5]、[6]、[7]、[8]。细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性机制主要涉及三个方面：首先，编码青霉素结合蛋白（PBPs）的基因突变降低了抗生素的识别和结合能力；其次，细胞壁或外膜通透性的改变阻止了抗生素的进入；第三，产生的β-内酰胺酶水解了β-内酰胺类抗生素的酰胺键。其中，后者是革兰氏阴性细菌中最关键的耐药机制之一[9]、[10]、[11]、[12]。β-内酰胺酶协调并激活水分子攻击β-内酰胺，使抗生素失效，无法抑制PBPs[13]、[14]。PBPs是参与细菌细胞壁肽聚糖合成和重塑的关键酶。β-内酰胺类抗生素通过靶向细菌表面的PBPs发挥杀菌作用，它们使PBPs的活性丝氨酸残基酰化，形成稳定的酰基化部分，从而阻止PBPs参与细菌细胞壁的合成[15]、[16]、[17]。这些酶在其活性位点含有反应性丝氨酸残基（丝氨酸β-内酰胺酶）或至少一个具有催化功能的二价锌离子（金属β-内酰胺酶）。根据氨基酸序列，β-内酰胺酶被分为不同的分子类别（A、B、C和D）[4]、[18]。A类β-内酰胺酶数量最多，具有最广的抗菌谱，包括扩展谱β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶。B类β-内酰胺酶，也称为金属β-内酰胺酶，是位于移动遗传元件中的质粒编码酶，可以传播并携带其他类别抗生素的耐药基因，构成重大临床威胁。C类（AmpC）β-内酰胺酶对大多数头孢菌素具有耐药性，包括扩展谱头孢菌素如头孢他啶和头孢氧嗪。染色体AmpC β-内酰胺酶的基线表达通常较低，但接触某些β-内酰胺类抗生素可诱导其高水平表达。质粒编码的AmpC β-内酰胺酶容易水解头孢氧嗪。此外，由于强启动子和高拷贝数，质粒编码的AmpC β-内酰胺酶变体的表达水平较高。随着这些质粒的广泛传播，它们对公共卫生的影响日益增加，对许多临床治疗构成严重威胁。D类β-内酰胺酶，也称为氧西林水解酶，近年来因其中一些成员能够水解碳青霉烯类抗生素而变得越来越重要[19]、[20]。

抗生素助剂在单独使用时几乎没有或完全没有抗菌活性，但当与抗生素联合使用时可以恢复或增强其疗效[21]。抗生素助剂被认为是一个有前景的方向，通过延长现有抗生素的寿命和减少开发新药的紧迫性而具有优势[22]。第一代β-内酰胺酶抑制剂（称为自杀失活剂）可以失活目标β-内酰胺酶。然而，长期使用导致越来越多的耐药菌株出现[21]、[23]。随后，开发了第二代β-内酰胺酶助剂（通过可逆结合β-内酰胺酶起作用）和非β-内酰胺类β-内酰胺酶抑制剂，如硼酸类似物和磷酸酯[24]、[25]。尽管在应对耐药性方面取得了进展，但小分子抑制剂往往难以有效靶向和穿透细菌，从而显著降低其疗效[26]、[27]。由于抗生素靶向性差、酶降解等因素，抑制剂必须与高剂量的抗生素联合使用才能达到治疗效果，这加剧了细菌耐药性和宿主毒性[28]。

在这里，我们设计了一种由麦芽六糖修饰的聚(5-甲基-三甲基亚甲基碳酸酯-苯并氮杂硼杂环)（AM-PMB）作为大分子抗生素助剂，它可以自组装成纳米级颗粒，以逆转细菌对β-内酰胺类的AmpC相关耐药性（图1a）。该纳米助剂由亲水链段麦芽六糖和含有苯并氮杂硼杂环侧基的疏水链段聚碳酸酯组成。麦芽六糖是细菌葡萄糖的主要来源，利用哺乳动物细胞中缺乏麦芽糊精转运蛋白的特点[29]、[30]，使纳米助剂能够被细菌轻易吸收。纳米助剂表面的苯并氮杂硼杂环与细菌细胞壁中的邻二醇基团结合，捕获细菌，并通过与丝氨酸形成可逆的共价键有效抑制AmpC。在本研究中，选择了K. pneumoniae和一种过表达AmpC的头孢氧嗪诱导衍生物菌株作为代表性模型。K. pneumoniae是一种具有临床意义的革兰氏阴性细菌，可引起多种严重的医院内感染，并已发展出多重耐药性，尤其是对β-内酰胺类抗生素的耐药性。此外，质粒介导的AmpC酶在K. pneumoniae中的临床相关性已经得到证实。AmpC β-内酰胺酶在细菌细胞质中以前体蛋白的形式合成，其N端含有信号肽。前体通过Sec转运系统穿过膜后，在周质空间折叠并主要定位于该区域，水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环。该菌株用于研究基于苯并氮杂硼杂环的纳米助剂是否可以恢复β-内酰胺类抗生素对临床重要革兰氏阴性病原体的活性。该助剂还作为载体，将抗生素输送到细菌内部，增强体内的治疗效果。当通过鼻腔给药时，助剂可以精确捕获并进入细菌，使耐药性K. pneumoniae重新对头孢氧嗪钠（CFS）敏感（图1b）。该策略成功治愈了由β-内酰胺类抗生素耐药的K. pneumoniae引起的肺炎，为有效管理多重耐药细菌感染提供了实用的新方法。

章节片段

纳米助剂MPMB@CFS的制备与表征

β-内酰胺类抗生素是临床治疗中最常用的抗菌剂，因为它们具有高效性、安全性和广谱抗菌活性[2]、[3]、[4]。在革兰氏阴性细菌中，水解β-内酰胺环酰胺键的β-内酰胺酶仍然是这些抗生素耐药性的主要机制[13]。为了解决恢复头孢菌素活性的问题，我们设计了一种多价大分子助剂，能够

结论

总之，我们成功开发了一种纳米助剂，它作为β-内酰胺酶抑制剂使用，能够逆转细菌对β-内酰胺类的耐药性，而不会引发进一步的耐药性。该纳米助剂通过特异性识别麦芽糖有效捕获细菌并进入细菌细胞，随后通过多价相互作用与AmpC结合，保护β-内酰胺类抗生素免受酶降解，从而增强抗生素对耐药性K. pneumoniae的疗效

支持信息

实验细节、材料和方法；化合物1–8和AM-PMB的合成及NMR光谱；AM、PMB和AM-PMB的¹H NMR光谱和FTIR光谱；MPMB₁₀、MPMB₂₀、MPMB₅₀的制备、粒径分布直方图、TEM图像、生物相容性评估及细菌捕获能力评估；MPMB@CFS的药物释放分析；体外和体内实验方法；不同温度下MPMB₅₀@EB在K. pneumoniae中的内化CLSM图像；K.的SIM图像。

CRediT作者贡献声明

高英超：撰写——原始草稿，可视化，验证，项目管理，研究，数据分析，概念化。王宏宇：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，可视化，验证，项目管理，研究，数据分析，概念化。薛云：可视化，验证，方法学，研究，数据分析。张玉飞：可视化，验证，软件。黄思远：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（资助编号：21975133；22475108；82370844）的财政支持。我们还要感谢南开大学药物化学生物学国家重点实验室提供的超分辨率成像系统SIM & SMLM，以及张燕的帮助。