一种可植入的活体微针贴片，用于持续释放细胞外囊泡并促进子宫功能再生

《Nano Today》：A Living UCMSC-embedded microneedle patch for sustained extracellular vesicles delivery and functional uterine regeneration

　　

陈亮|郭文焕|毛德志|栾鹏飞|王海芳|曾忠红|王静|顾梦清|刘慧|李冠林|郭青|李丹|魏伟|朴学娇|刘凯月|李欣然|傅波|李蓉|陈彦东|杨宇

中国北京北京大学第三医院妇产科生殖医学中心女性生育促进国家重点实验室

摘要

剖宫产后子宫纤维化和粘连是导致继发性不孕的主要原因，需要创新的局部治疗方法。本文设计了一种混合多孔微针（MN）-水凝胶贴片来应对这一挑战。该贴片将活的脐带间充质干细胞封装在明胶甲基丙烯酸酯水凝胶储库中，并将其固定在可生物降解的多孔微针阵列上，以实现直接组织锚定。这种设计使干细胞在贴片内的存活时间至少达到28天，并能够局部释放干细胞衍生的细胞外囊泡，从而在伤口部位持续提供旁分泌效应。在严重子宫损伤的小鼠模型中，该贴片显著抑制了纤维化，促进了血管生成和肌层再生，最终使生育能力恢复到与健康对照组相当的水平。该平台通过整合蛋白质组学、生物信息学和功能验证，积极重塑了损伤微环境。这种治疗策略为无疤痕组织再生提供了有希望的途径。

引言

不孕症是一个全球性的健康问题，估计影响着全球10-25%的育龄夫妇[1]、[2]、[3]。大约6%接受生育治疗的女性存在子宫功能障碍[4]。随着全球剖宫产率的持续上升（2000年为1600万例，2015年为2970万例）[5]、[6]、[7]，研究人员越来越关注剖宫产与后续生育能力之间的潜在不良关联。事实上，一些研究表明，剖宫产后瘢痕缺陷（发生率为19-86%）可能导致后续的产科并发症，如月经异常、不孕和子宫破裂[8]、[9]。这些并发症对育龄妇女的健康构成重大威胁[4]、[10]。尽管临床医生不断努力改进剖宫产技术并减少创伤，但目前的子宫修复策略（如激素药物、冷冻疗法）仍不足以充分恢复生育能力，常常由于剖宫产瘢痕缺陷（CSDs）和子宫内粘连[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]而导致不可逆的不孕。更糟糕的是，全身给药往往无法达到有效的局部药物浓度，还可能引发激素失衡，例如外源性雌激素治疗会增加心血管风险[17]、[18]、[19]。因此，需要新的策略来恢复受损子宫的结构和功能。

干细胞疗法在生物医学研究中展现出广阔的应用前景[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。越来越多的证据表明，间充质干细胞（MSCs）因其强大的生物活性而成为再生医学的理想候选细胞[26]、[27]。这些细胞具有高自我更新能力、多向分化潜能和广泛的组织来源。更重要的是，MSC衍生的旁分泌因子（如免疫调节、抗炎、血管生成、抗凋亡和营养支持）在不同类型的组织修复中起着关键作用[28]、[29]、[30]。最近的研究表明，MSCs可用于治疗与不孕相关的疾病，尤其是早发性卵巢衰竭和子宫内膜功能障碍[31]、[32]。同时，MSCs改善子宫愈合的能力也得到了研究[33]。然而，临床应用的干细胞通常通过静脉注射等全身途径给药，其中超过60%的细胞会在肺部被捕获，严重限制了其在目标组织的归巢效率和治疗效果[34]。此外，直接将干细胞移植到受损组织还会受到微环境引起的细胞死亡和功能损伤的限制，极大地阻碍了临床转化[35]、[36]、[37]。尽管细胞外囊泡（EVs）作为MSCs的旁分泌效应器在组织修复中具有治疗潜力，但其直接移植可能导致在受损组织中的保留不足，从而对临床转化构成挑战[38]、[39]。因此，开发有效的策略以增强局部和持续的治疗效果至关重要。随着刺激响应纳米平台的发展，微针贴片已被用于原位给药[40]、[41]、[42]、[43]、[44]。

在本研究中，我们使用明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）制备了一种多孔微针（MN）阵列，其微针尖端具有适当的孔径，便于在剖宫产切口部位释放MSC-EVs。同时，装载了活的脐带MSCs（UCMSCs）的水凝胶基底被设计为能够持续释放MSC-EVs（图1）。这种材料由于其优异的生物相容性和可调的生物降解性，为UCMSCs提供了良好的长期生存环境，增强了治疗效果，而无需MSCs侵入子宫伤口[45]、[46]、[47]。此外，水凝胶基底还可以防止伤口与腹部组织之间的粘连形成。由于这些特性，MN-MSC贴片在至少28天内有效支持了MSC的存活，促进了血管生成、肌层重建和子宫内膜再生，从而提高了小鼠的妊娠率和活产率。所有这些特点凸显了MN-MSC贴片不仅在处理剖宫产伤口方面的治疗潜力，而且作为一种多功能平台，可用于活细胞分泌组的持续和局部给药，在慢性皮肤伤口和心肌修复等再生医学领域具有广泛的应用前景。

章节片段

MN阵列的制备和表征

多孔微针（MN）阵列使用聚二甲基硅氧烷模具从多孔GelMA（EFL-GM-PR-001）中制备。在37°C下制备6%（w/v）的GelMA溶液，然后倒入模具中，并通过真空抽吸去除气泡。将铸型溶液在37°C下干燥10小时，随后通过紫外线照射（405 nm，30 mW/cm2，15 s）进行交联。固化的微针从模具中小心取出。每个微针的基底直径为280 μm，锥形高度为800 μm。

体外MN-MSC贴片的制备和表征

首先将GelMA预聚物溶液倒入负微模具中形成MN结构。经过真空处理填充空腔后，通过紫外线照射（Figs. 2A, a1-a4）使微针固化。扫描电子显微镜（SEM）显示微针呈圆锥形，基底和高度尺寸分别为280 μm和800 μm（Figs. 2C、2D）。为了确保MSC分泌组的持续释放，将装载了MSCs的GelMA水凝胶应用于...

结论

总之，MN-MSC贴片在子宫损伤的再生治疗方面取得了重大进展。通过整合持续的、局部的MSC旁分泌因子来源和保护性给药系统，该策略有效克服了传统细胞疗法的关键限制，成为一个多功能微/纳米工程平台，用于活细胞分泌组的输送。我们的多方面分析表明，该贴片协调了修复过程，包括...

CRediT作者贡献声明

李丹：资源提供。陈亮：撰写——原始草稿、方法学、研究设计、资金获取、数据分析。魏伟：资源提供。郭文焕：验证、方法学。朴学娇：资源提供。毛德志：可视化、软件、方法学、研究设计、数据分析。刘凯月：资源提供。栾鹏飞：可视化、软件、研究设计、数据分析。李欣然：资源提供。王海芳：软件、资源提供。曾忠红：方法学、研究设计。傅波：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了以下项目的支持：国家自然科学基金（82192873、82225019、32501008）、国家重点研发计划（2024YFC2706600、2024YFA1106900、2022YFA1103602）、北京大学第三医院重点临床项目（BYSYZD2024027、BYSYRCYJ2024008）、北京诺瓦计划（20240484604）、首都临床诊断与治疗技术研究及转化应用专项（Z211100002921054）、天福。