《International Journal of Oral Science》：Osteoblast-derived CAR3 synergizing with collagen and bone sialoprotein enhances bone formation
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成骨细胞调控矿化前体在胶原纤维内的浸润与结晶过程，部分成骨细胞分泌的促矿化蛋白可进一步促进骨形成。本研究通过对小鼠颅骨与长骨进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，发现碳酸酐酶III（Car3）在成骨细胞中存在显著的表达模式。研究人员揭示了CAR3在成
成骨细胞调控矿化前体在胶原纤维内的浸润与结晶过程，部分成骨细胞分泌的促矿化蛋白可进一步促进骨形成。本研究通过对小鼠颅骨与长骨进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，发现碳酸酐酶III（Car3）在成骨细胞中存在显著的表达模式。研究人员揭示了CAR3在成骨细胞谱系细胞中的关键作用，证实其对骨骼发育与稳态维持至关重要。在Prx1谱系细胞中条件性敲除Car3会导致骨量减少与成骨细胞活性显著受损，明确了其功能必要性。机制层面，核心转录因子RUNX2直接调控Car3表达，介导其在发育过程中的时空特异性表达。值得注意的是，CAR3通过与Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）及骨唾液蛋白（BSP）形成三元复合物，促进胶原纤维内矿化，进而驱动矿物沉积。此外，CAR3功能化支架可通过同时促进基质矿化与招募Prx1谱系细胞，显著提升骨修复与再生效果。这些发现确立CAR3是成骨细胞分化与胶原纤维间矿化的关键协调因子，是维持骨骼完整性并实现再生的核心介质。
该研究针对骨骼发育与稳态维持的分子调控机制展开，聚焦于成骨细胞主导的生物矿化过程。当前领域内已知非胶原蛋白（NCPs）如骨唾液蛋白（BSP）、骨钙素（OCN）等在矿化中发挥调控作用，但胶原纤维内有序矿化的精确分子协调机制尚未完全阐明。尤其碳酸酐酶家族成员CAR3虽在骨骼肌代谢中功能明确，其在骨骼系统中的时空表达特征与具体作用机制尚属未知。鉴于单细胞测序数据显示Car3在成骨细胞中特异性高表达且与矿化进程同步，研究人员推测其可能参与骨形成的调控，因此开展此项研究以明确CAR3在骨骼发育、稳态及再生中的功能与分子机制。
研究人员采用小鼠遗传学模型结合多组学分析与材料学验证，系统阐明了CAR3的作用。通过条件性敲除小鼠模型，证实成骨谱系特异性缺失Car3导致成年小鼠骨量显著下降、成骨活性受损。机制研究发现RUNX2直接结合Car3启动子调控其表达；CAR3蛋白通过同时结合COL1A1与BSP形成三元复合物，促进无定形磷酸钙（ACP）在胶原纤维内的浸润与定向结晶。功能上，CAR3功能化胶原支架能有效招募Prx1阳性祖细胞并促进原位骨缺损修复。该研究首次将CAR3定义为连接有机基质组装与无机矿物沉积的关键分子桥梁，为理解骨形成机制及开发新型骨再生策略提供了重要靶点，论文发表于《International Journal of Oral Science》。
关键技术方法包括：利用公共数据集与自测样本开展小鼠胚胎颅骨及成年长骨的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析；构建Prx1-Cre驱动的Car3条件性敲除小鼠模型评估骨骼表型；通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）与启动子分析明确转录调控关系；采用免疫共沉淀（Co-IP）、质谱与分子对接技术解析蛋白互作界面；利用聚合物诱导液态前体（PILP）体系开展体外胶原纤维内矿化实验；构建CAR3功能化胶原支架并进行小鼠颅骨临界尺寸缺损修复评估。所有体内实验均使用C57BL/6背景小鼠。
研究结果如下：
胚胎骨发育过程中CAR3的表达与矿化动态
对E17.5小鼠颅骨单细胞数据的拟时序分析显示，Car3表达在成骨分支形成后显著上调，与矿化起始期（E14.5-E15.5）精准对应。免疫荧光证实CAR3蛋白水平随矿化进程升高，且在Prx1阳性基质细胞中富集，组织透明成像显示其在颅面骨、长骨及中轴骨中广泛表达。
出生后肢骨成骨细胞谱系中Car3的高表达
成年小鼠股骨单细胞数据证实Car3在成骨细胞谱系中持续高表达，与Col1a1、Dmp1等成骨标志物共定位。在8周龄小鼠中，CAR3与活跃成骨区域的钙黄绿素标记带重合；而在12月龄老年小鼠中，CAR3主要定位于骨髓脂肪细胞，且Car3缺失会增强间充质干细胞的成脂分化倾向。
Car3是RUNX2的转录靶点
免疫荧光显示Runx2杂合缺失小鼠骨组织中CAR3表达显著降低。ChIP-seq数据分析发现RUNX2在Car3启动子区域存在强结合峰，且在成骨早期结合最强。过表达RUNX2可显著上调BMSCs中Car3转录，而SP7过表达无此效应，表明RUNX2直接且特异性地调控Car3表达。
CAR3在BMSCs成骨分化中起关键作用
超分辨显微成像显示CAR3在BMSCs矿化晚期表达上调，并分泌至细胞外囊泡（EVs）及胶原纤维中。功能实验表明，敲除Car3显著减少钙结节形成并下调成骨标志物表达，而过表达CAR3则促进矿化。
CAR3缺失通过抑制成骨活性降低骨量
Prx1-Cre; Car3fl/fl小鼠出生时骨骼发育正常，但8周龄时表现为骨小梁与皮质骨骨量全面下降，骨形成率显著降低，而破骨细胞活性与生长板形态未见异常。
CAR3通过结合COL1A1并招募BSP调控胶原纤维内矿化
分子对接与Co-IP证实CAR3可直接结合COL1A1。在PILP体系中，CAR3处理的胶原纤维直径增加且矿化更完全。质谱与pull-down实验显示CAR3同时结合COL1A1与BSP，形成三元复合物，促进BSP在胶原纤维上的募集，从而引导ACP的浸润与结晶。
CAR3功能化胶原支架增强骨缺损愈合
在小鼠颅骨3mm临界缺损模型中，植入CAR3修饰的胶原支架较未修饰对照组显著增加新生骨体积与矿化密度，并有效招募更多Prx1谱系细胞至缺损区。
讨论与结论总结
研究证实CAR3是成骨细胞终末分化的标志分子，由RUNX2直接转录激活，独立于SP7调控轴。不同于海洋生物钙化中碳酸酐酶的催化供离子功能，哺乳动物CAR3主要通过蛋白互作模式发挥作用。其作为支架蛋白，通过锚定COL1A1并招募BSP，形成功能性三元复合物，解决胶原间隙内矿物有序沉积的空间约束问题。条件性敲除模型显示CAR3缺失导致成年期骨丢失，而CAR3功能化生物可降解胶原支架能同时提供物理支撑与生物活性指令，实现高效的骨再生。该研究确立了CAR3作为协调成骨分化与基质矿化的核心枢纽，为骨缺损修复材料的研发提供了新范式。局限性在于尚未解析介导胶原结合的具体结构域，以及BSP被招募至胶原孔区（hole zone）的精确生化机制。
