通过自由能优化技术改造硫酸软骨素裂解酶AC，以提高其热稳定性和催化效率

《Process Biochemistry》：Engineering of Chondroitin Sulfate Lyase AC to Improve the Thermostability and Catalytic Efficiency with Free Energy Optimization

　　

李阳楠|王子瑜|吴月|韩彤|司文杰|李玉婷|张叶旺

江苏大学药学院，镇江，212013，中国

摘要

硫酸软骨素裂解酶被广泛用于降解糖胺聚糖，但其热稳定性常常限制了其实际应用。在这项研究中，采用了一种以稳定性为导向的蛋白质工程策略来提高硫酸软骨素裂解酶AC的性能。使用FoldX和DynaMut2对突变体进行了能量优化和稳定性预测，最终鉴定出一种双突变体A42D/S62P，其热稳定性显著提高。在37°C下的半衰期比野生型（WT）延长了4.48倍，同时特异性活性提高了23.80%。分子动力学模拟表明，稳定性提高的主要原因是局部相互作用增强以及动态区域的构象灵活性降低。此外，综合催化性能指标显示，工程化酶在操作条件下的有效催化输出几乎提高了两倍。这些结果突显了基于自由能的计算设计在提高酶稳定性和性能方面的有效性，并证明硫酸软骨素裂解酶突变体在生物催化应用中表现出更好的性能。

引言

由于固有的选择性和温和的操作条件，酶被广泛认为是高效的生物催化剂[1]、[2]、[3]。然而，天然酶的实际应用受到多种因素的限制，其中在工业条件下的稳定性不足是最关键的因素之一[4]、[5]。这种不稳定性直接导致催化性能下降、酶消耗增加和工艺成本上升。为了提高工业酶的稳定性，蛋白质工程已成为一种有效的策略[6]、[7]。在可用的方法中，计算辅助的半理性设计有效地减少了繁琐的突变体筛选过程，同时保持了预测准确性，并已广泛应用于酶性能优化[8]、[9]。特别是基于蛋白质折叠自由能变化（ΔΔG）的计算设计能够定量评估突变对蛋白质结构稳定性的影响，为工程化酶稳定性提供了一种更精确和可控的方法[10]、[11]。

硫酸软骨素裂解酶是一类具有重大生物医学意义的糖胺聚糖降解酶[12]、[13]、[14]。根据底物特异性，硫酸软骨素裂解酶通常被分为AC、B和ABC三种类型[15]。其中，硫酸软骨素裂解酶AC（ChonAC）通过β-消除机制催化硫酸软骨素A和C的降解[16]。重要的是，这一过程保留了对生物功能至关重要的天然硫酸化模式[17]、[18]。由于这一特性，ChonAC已被应用于生产低分子量硫酸软骨素（LMWCS）以及在肝素纯化过程中去除硫酸软骨素杂质等过程中[19]。

鉴于其重要的应用潜力，如果ChonAC具有足够的催化活性和热稳定性，它将是一个理想的催化剂。尽管已经从多种细菌来源分离并表征了ChonAC[20]、[21]、[22]，但大多数报道的酶的催化效率有限，其中来自F. heparinum的酶的最高特异性活性为46.90 U/mg[20]。来自P. xixiisoli的硫酸软骨素裂解酶AC（PxChonAC）之前被分离出来以解决低催化活性的问题[23]，其特异性活性显著提高至522.30 U/mg[24]。然而，它的热稳定性较差，在37°C下的半衰期仅为约4.98分钟。这一缺陷使得它难以达到工业应用所需的催化效率和经济可行性[25]。

通过蛋白质工程提高ChonAC的热稳定性同时保持其高催化效率仍然是一项关键任务。在我们之前的工作中，通过工程化末端区域的高灵活性残基，将PxChonAC的半衰期从4.98分钟延长到了19.55分钟[24]。相比之下，其他硫酸软骨素裂解酶（如硫酸软骨素裂解酶ABC和硫酸软骨素裂解酶B）的稳定性工程取得了更大的进展。例如，Wang等人通过结构分析和共识序列设计相结合的方法，提高了PvChSaseABC的热稳定性，使其在37°C下的半衰期达到了1152.00分钟，而野生型的半衰期为4.66分钟[18]。同样，Xu等人的克隆和表达研究揭示了来自Pedobacter saltans的硫酸软骨素裂解酶B（PsChonB）的高稳定性。PsChonB的溶剂可及表面积较小，ΔΔG（54.44 kcal·mol^-1）低于PhChonB（74.69 kcal·mol^-1），表明其结构更加紧凑和稳定[26]。

基于之前的工作，本研究以高活性的PxChonAC为模板，应用ΔΔG引导的半理性设计策略来工程化稳定突变。具体来说，结合使用FoldX[27]和DynaMut2[28]来鉴定能够增强稳定性同时最小化潜在催化活性损害的突变。根据这些预测，获得了一种双突变体（A42D/S62P），其在热稳定性和催化活性方面都得到了提升。进一步的分子动力学模拟和结构分析表明，柔性环区域的刚性化可能是稳定性和活性协同提高的原因。这些结果不仅证明了基于ΔΔG的设计方法适用于ChonAC的工程化，也为相关多糖裂解酶提供了见解。

章节片段

材料与试剂

定点突变试剂盒、Pfu DNA聚合酶、dNTP、Fast Digest Dpn I、柱式质粒迷你制备试剂盒、E. coli DH5α和E. coli BL21(DE3)感受态细胞均购自Sangon Biotech有限公司（上海，中国）。异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）购自Aladdin Biochemical Technology有限公司（上海，中国）。Ni-NTA树脂购自Chromsep Biotech有限公司（青岛，中国）。硫酸软骨素A钠盐购自Sigma-Aldrich公司

在PxChonAC中计算筛选稳定突变

利用计算预测的ΔG来指导PxChonAC中稳定突变的鉴定。通过FoldX进行的虚拟饱和突变筛选发现了481个单点突变，这些突变预计可以降低折叠自由能（ΔΔG? < 0），表明具有潜在的稳定效果（图1A）。如图1B所示，进一步筛选了那些位于蛋白质表面且远离活性位点的突变，以减少对催化性能的影响

结论

总之，开发了一种基于自由能的蛋白质工程策略来提高PxChonAC的工业适用性。通过综合计算筛选，发现双突变体A42D/S62P在保持高酶活性的同时显著提高了热稳定性。根据结构分析，柔性环区域的刚性增加是稳定性的主要因素，并同时为结构提供了加强支持

CRediT作者贡献声明

李阳楠：撰写——原始草稿、方法学、实验研究。韩彤：验证。王子瑜：验证。吴月：验证、实验研究。张叶旺：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。李玉婷：验证。司文杰：验证。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

王子瑜女士感谢江苏省大学生创新培训项目（项目编号S202510299161）的支持。