铜-空心介孔聚多巴胺-聚丙烯酸纳米平台用于实现光声成像引导的光热/化学动力学治疗骨肉瘤

《RSC Chemical Biology》：Copper-hollow mesoporous polydopamine-polyacrylic acid nanoplatform enabling photoacoustic imaging-guided photothermal/chemodynamic therapy for osteosarcoma

　　

骨肉瘤（OS）是一种极具破坏性和致死性的原发性骨癌，其治疗仍然是一个巨大的挑战。研究人员构建了一种纳米平台（HMPDA-Cu@PAA），通过将铜离子载入空心介孔聚多巴胺（HMPDA）并随后包覆聚丙烯酸（PAA）制备而成，该平台表现出对肿瘤微环境（TME）和外源性808 nm近红外（NIR）激光照射的双重响应。TME中Cu+和Cu2+的相互转化赋予了HMPDA-Cu@PAA NPs两种酶样活性：过氧化物酶样（POD-like）和谷胱甘肽过氧化物酶样（GPx-like）活性。HMPDA-Cu@PAA NPs表现出结合化学动力学治疗（CDT）、光热治疗（PTT）和光声成像（PAI）能力的协同治疗能力。所制备的HMPDA-Cu@PAA在特定TME响应下刺激生成有毒的羟基自由基（˙OH），并耗尽细胞内谷胱甘肽（GSH）以杀死MG63细胞，具有显著的细胞毒性效应。此外，PTT引起的局部温度升高促进了有毒˙OH的生成，从而实现对OS治疗的PTT/CDT协同增强。作为一种用于OS的PAI引导多模式治疗的强大纳米酶，HMPDA-Cu@PAA纳米平台在MG63荷瘤小鼠模型中表现出81.36%的显著肿瘤抑制率（TIR）。总之，本研究提出了一种多功能且合理设计的纳米平台，为PAI引导的、TME激活的多模式OS诊疗提供了一个有前景的范式。

该研究论文发表在《RSC Chemical Biology》。骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是一种源于间充质细胞衍生的成骨前体细胞的原发性恶性骨肿瘤，也是儿科患者癌症相关死亡的第二大原因。目前临床治疗策略主要包括手术干预、化疗（包括新辅助和辅助治疗）和放疗。然而，由于放化疗的不良反应以及手术干预无法完全清除肿瘤，治疗效果仍不尽如人意。现有的OS治疗方法的局限性促使研究人员开发新型、高效且安全的治疗方法，这对于提升OS的整体管理水平至关重要。

化学动力学治疗（Chemodynamic Therapy, CDT）是利用肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中稍酸性的条件，通过Fenton或类Fenton反应将过量的过氧化氢（H₂O₂）转化为高毒性的羟基自由基（˙OH）来杀死肿瘤细胞的治疗方式。传统的Fe²⁺催化的Fenton反应仅在pH < 4的强酸性条件下有效，在肿瘤弱酸性条件下的反应速率和治疗效率相对较低。相比之下，在TME的弱酸性条件下，Cu⁺介导的类Fenton反应比Fe²⁺催化的反应效率高得多。此外，癌细胞中升高的谷胱甘肽（Glutathione, GSH）水平可以驱动Cu²⁺和Cu⁺之间的氧化还原循环，导致GSH消耗，从而增强CDT的治疗效果。然而，单一CDT往往不足以根除肿瘤，大多数铜基纳米平台被设计为基于CDT的联合治疗以实现更完全的肿瘤清除。

光热治疗（Photothermal Therapy, PTT）是一种利用光热效应进行治疗的肿瘤消融策略，因其微创、选择性高和副作用少而在癌症治疗中受到越来越多关注。聚多巴胺（Polydopamine, PDA）基材料由于其优异的生物相容性、可生物降解性、强近红外（Near-Infrared, NIR）吸收特性以及提供金属离子锚定位点的丰富儿茶酚基团，在PTT和光声成像（Photoacoustic Imaging, PAI）等应用中显示出巨大潜力。CDT和PTT的协同组合已被证明是OS治疗的有效联合策略。此外，铜基材料和PDA纳米材料在808 nm NIR激光照射下具有出色的光热性能，不仅可以直接通过热机制诱导肿瘤细胞死亡，还可以加速肿瘤协同CDT中的类Fenton反应。

PAI利用组织吸收光能后热膨胀产生的超声波信号进行检测，具有无创和高灵敏度的特点。铜基纳米材料因能够产生光声信号并与PTT和CDT等各种疗法协同作用，以及其高组织穿透性、无创性和优异的生物相容性而备受关注。

鉴于此，研究人员构建了一种纳米平台（HMPDA-Cu@PAA），通过将铜离子载入空心介孔聚多巴胺（Hollow Mesoporous Polydopamine, HMPDA）并随后包覆聚丙烯酸（Polyacrylic Acid, PAA），旨在实现OS的PAI引导多模式治疗（CDT–PTT）。HMPDA-Cu是通过铜离子与HMPDA的儿茶酚和胺官能团之间的配位螯合合成的。HMPDA-Cu@PAA纳米平台作为高效的光声造影剂（Contrast Agent）和PTT剂，同时也表现出优异的过氧化物酶样（Peroxidase-like, POD-like）酶活性。在808 nm NIR激光照射下，HMPDA-Cu@PAA有效吸收光能并促进TME中Cu⁺/Cu²⁺氧化还原循环，以实现OS的多模式治疗。体内实验结果表明，HMPDA-Cu@PAA能有效抑制OS，凸显了其在实体瘤治疗中的巨大潜力。

为开展此项研究，研究人员主要采用了以下关键技术与方法：通过软模板法合成HMPDA NPs，利用配位相互作用载入铜离子合成HMPDA-Cu NPs，并通过PAA包覆获得HMPDA-Cu@PAA NPs；使用透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、N₂吸附-脱附、Zeta电位和流体动力学直径测量等进行表征；评估光热转换效率、GSH消耗能力、POD-like酶活性（甲基蓝降解、电子顺磁共振EPR、四甲基联苯胺TMB氧化）及Cu价态变化；采用MTT法、活/死细胞染色、DCFH-DA探针、伤口愈合和Transwell侵袭实验进行MG63和L929细胞的体外评价；建立MG63荷瘤小鼠模型，进行PAI、红外热成像、肿瘤体积与体重监测、H&E和TUNEL染色、溶血实验、血液生化分析及ICP-MS器官铜定量等体内评价。

2.1. HMPDA-Cu@PAA NPs的构建与表征

研究人员描述了HMPDA-Cu@PAA NPs的合成过程与应用。HMPDA NPs采用先前报道的软模板法制备，并稍作修改。HMPDA-Cu NPs通过铜离子与HMPDA的儿茶酚和胺基团之间的配位相互作用合成。为了增强胶体稳定性，HMPDA-Cu NPs包覆了PAA。TEM确认成功合成了HMPDA NPs、海胆状结构的HMPDA-Cu NPs和HMPDA-Cu@PAA NPs，粒径分别为149.6 ± 10.8 nm、170.2 ± 20.5 nm和177.8 ± 20.7 nm。TEM元素映射分析进一步揭示HMPDA-Cu@PAA NPs由Cu、C、N和O元素组成。HMPDA和HMPDA-Cu的N₂吸附-脱附等温线呈现典型的IV型，确认了其介孔结构。铜配位后，Brunauer–Emmett–Teller（BET）比表面积从120.39 m²g^?1显著降至45.22 m²g^?1，孔径分布曲线也显示主导孔径明显减小。Zeta电位分析显示HMPDA呈负表面电荷，引入铜离子后HMPDA-Cu呈正表面电荷，PAA包覆后Zeta电位从+20.1 ± 0.4 mV变为?12.9 ± 0.6 mV，进一步确认了Cu离子的成功掺入和PAA的有效封装。流体动力学直径分别为204.4 ± 7.3 nm、243.3 ± 7.1 nm和261.5 ± 5.9 nm。HMPDA-Cu@PAA NPs在48小时观察期内表现出相当的稳定性，无明显团聚。XPS分析揭示了Cl 2p、C 1s、N 1s、O 1s和Cu 2p的结合能峰，C 1s、N 1s、O 1s、Cl 2p和Cu 2p的高分辨光谱证实了相应的化学相互作用及Cu的单价和二价存在，表明铜与HMPDA中的活性基团（如氨基、羟基和羧基）配位。溶血实验显示，在100、200和500 μg mL^?1浓度下共孵育4小时后，溶血率分别为1.80%、2.61%和4.24%，均低于5%的安全阈值，表明HMPDA-Cu@PAA NPs在血液环境中具有良好的生物相容性。

2.2. 光热性能表征

研究人员评估了HMPDA-Cu@PAA NPs的光热性能。在2 W cm^?2的808 nm NIR激光照射下，随着NPs浓度（50、100、200 μg mL^?1）增加，温度显著升高；在固定浓度下，增加激光功率也会导致溶液温度更明显升高。根据冷却曲线测量，HMPDA-Cu@PAA NPs的光热转换效率为41.44%，显著高于此前报道的HMPDA NPs的23.53%。在五轮加热和冷却循环中，温度变化几乎保持稳定，TEM图像显示五轮辐照后无明显变化，证实了优异的热稳定性。综上，HMPDA-Cu@PAA NPs在808 nm NIR激光照射下表现出出色的光热效能。

2.3. HMPDA-Cu@PAA NPs的酶活性评估

耗尽瘤内GSH可增强CDT效率，因为肿瘤细胞中高GSH水平提供抗氧化防御。含二价铜离子的HMPDA-Cu@PAA NPs不仅可以耗尽GSH，还可转化为Cu⁺以促进类Fenton反应。Ellman法（DTNB法）评估显示，随着NPs浓度增加，GSH消耗程度逐渐增强，证实了出色的GSH消耗能力，可有效降低肿瘤细胞GSH水平并增强CDT治疗效率。POD-like活性通过亚甲基蓝（MB）降解反映，表明有效的活性氧（ROS）生成。实验结果表明，随着NPs浓度增加、pH降低、反应温度升高、反应时间延长和H₂O₂浓度增加，ROS生成逐渐增强。这说明HMPDA-Cu@PAA NPs在弱酸性TME条件下能有效诱导˙OH生成，表现出优异的类芬顿催化能力。EPR光谱使用DMPO作为自旋捕获剂，仅在含HMPDA-Cu@PAA NPs（100 μg mL^?1）和H₂O₂（100 μM）的混合物（pH 6.5）中观察到1 : 2 : 2 : 1峰，确认了˙OH的生成。TMB氧化实验也表明HMPDA-Cu@PAA催化H₂O₂选择性转化为˙OH用于CDT。为研究催化机制，XPS分析了不同条件下HMPDA-Cu@PAA中Cu的价态：原始样品以Cu²⁺为主（Cu⁺占33.14%），GSH处理使Cu⁺比例显著增加至59.62%（Cu²⁺还原为Cu⁺），H₂O₂单独引起中等变化（42.39%），GSH和H₂O₂共存时Cu⁺比例降至51.65%，表明Cu⁺和Cu²⁺之间的动态相互转化。结合GSH消耗和ROS生成结果，这些发现支持了负责增强催化活性的Cu²⁺/Cu⁺氧化还原循环过程。

2.4. 体外联合抗肿瘤功效

研究人员使用MTT法评估了HMPDA-Cu@PAA NPs对MG63细胞的体外抗肿瘤功效。HMPDA-Cu@PAA NPs以浓度依赖方式抑制MG63细胞增殖。无H₂O₂时，HMPDA-Cu@PAA NPs对MG63细胞毒性较低，与100 μg mL^?1NPs孵育24小时后细胞活力仍达83.63%。HMPDA-Cu@PAA NPs加H₂O₂组（48.80%）、加808 nm NIR激光组（39.81%）均表现出显著的MG63细胞抑制；而HMPDA-Cu@PAA NPs加H₂O₂和808 nm NIR激光组（26.89%）细胞活性降低最明显。这归因于HMPDA-Cu@PAA NPs的TME响应类芬顿催化行为，以及CDT和PTT的协同作用。L929成纤维细胞与100 μg mL^?1NPs孵育24小时后活力超过86.65%，表明低细胞毒性。活/死细胞染色测试证实上述发现：PTT和CDT组均比PBS组具有更强的肿瘤细胞杀伤能力，联合PTT/CDT组的死亡MG63细胞数量显著更高，进一步凸显了协同治疗优势。

2.5. ˙OH生成能力评估

癌细胞与正常细胞不同，相当比例的癌细胞表现出升高的ROS水平，导致氧化应激加剧，使其更容易受到治疗引起的外部ROS的进一步损伤。HMPDA-Cu@PAA NPs具有显著的光热性能，可通过提高温度增强基于类芬顿反应的CDT，从而促进ROS生成以杀死癌细胞。研究人员使用DCFH-DA绿色荧光探针评估MG63细胞内ROS生成能力。单独使用808 nm NIR激光或H₂O₂时仅观察到微弱绿色荧光；HMPDA-Cu@PAA加H₂O₂组观察到明亮荧光，归因于其POD-like活性；HMPDA-Cu@PAA加H₂O₂和NIR（808 nm）照射后，绿色荧光进一步增强，证实了HMPDA-Cu@PAA优异的光热性能能促进类芬顿反应。

2.6. MG63细胞迁移和侵袭的抑制

抑制肿瘤细胞迁移和侵袭可进一步增强抗肿瘤治疗效果。研究人员通过伤口愈合和Transwell侵袭实验研究了HMPDA-Cu@PAA NPs对MG63细胞迁移和侵袭的影响。PBS、H₂O₂、HMPDA-Cu@PAA NPs、HMPDA-Cu@PAA加H₂O₂、HMPDA-Cu@PAA加808 nm NIR激光、以及HMPDA-Cu@PAA加H₂O₂和808 nm NIR激光处理的影响被评估。值得注意的是，HMPDA-Cu@PAA加H₂O₂和808 nm NIR激光组的MG63细胞愈合率显著低于其他组，对迁移的抑制效果最有效，表明PTT和CDT的组合显著抑制MG63细胞迁移。此外，Transwell侵袭实验显示该组侵入细胞数量最少，表明PTT和CDT的组合显著抑制MG63细胞侵袭。

2.7. PAI和光热性能评估

作为一种高效、无创的成像技术，PAI可以引导体内光热治疗。鉴于HMPDA-Cu@PAA NPs显著的NIR吸收，研究人员评估了其作为PAI造影剂的应用潜力。静脉注射HMPDA-Cu@PAA NPs后，确定了PAI引导PTT的合适时间点。肿瘤对信号的时间依赖性响应在静脉注射后12小时达到峰值。为评估光热效应，记录在注射PBS和HMPDA-Cu@PAA后，808 nm NIR激光暴露10分钟（注射后12小时）肿瘤部位的温度变化。PBS加808 nm NIR激光组温度仅上升3.7 °C，表明2.0 W cm^?2的808 nm NIR激光连续照射不会对荷瘤小鼠产生不利影响。相反，HMPDA-Cu@PAA NPs治疗组的肿瘤温度迅速上升19.4 °C。这些结果表明HMPDA-Cu@PAA NPs在体内表现出显著的EPR效应和优异的光热转换效率。

2.8. 抗肿瘤活性评估

研究人员建立了皮下MG63荷瘤小鼠模型以评估体内抗肿瘤功效。肿瘤大小约4–5 mm时静脉注射，注射后12小时进行激光照射（808 nm, 2.0 W cm^?2, 10 min）。每两天监测肿瘤体积和体重。第14天牺牲小鼠，取出肿瘤称重评估。HMPDA-Cu@PAA基治疗组的荷瘤小鼠未出现体重减轻，表明HMPDA-Cu@PAA NPs在系统水平导致最小的急性毒性。肿瘤体积增长分析表明，与对照组相比，HMPDA-Cu@PAA NPs组适度抑制肿瘤生长，而HMPDA-Cu@PAA NPs加808 nm NIR激光组由于CDT和PTT之间的协同相互作用，体内抗肿瘤效果最强。得益于PTT和CDT的协同效应，HMPDA-Cu@PAA NPs加808 nm NIR激光组抗肿瘤效果最显著，肿瘤抑制率（TIR）高达81.36%。肿瘤组织重量分析结果与此一致，该组平均肿瘤重量最低（233.13 mg）。随后进行TUNEL染色和H&E染色，表明与对照组相比，HMPDA-Cu@PAA NPs组和HMPDA-Cu@PAA NPs加808 nm NIR激光组均表现出更大的坏死区域和更高的凋亡水平。CDT和PTT联合治疗的细胞显示出最大的空白区域及核固缩，表明CDT和PTT联合治疗具有显著的协同抗肿瘤效应。

2.9. HMPDA-Cu@PAA NPs体内安全性评估

与对照组相比，包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在内的主要器官的组织学检查未显示治疗组有明显的病理异常。此外，分析了PBS组和HMPDA-Cu@PAA加808 nm NIR激光组MG63荷瘤小鼠的血液样本，以进一步评估血液学参数和肝功能相关指标。两组之间的血清生化标志物或血液学参数未观察到统计学显著差异。在注射后6、12和24小时，处死经HMPDA-Cu@PAA NPs治疗的荷瘤小鼠，收集主要器官和肿瘤通过ICP-MS进行铜定量。6小时时在肝脏中检测到高Cu水平。注射后12小时肿瘤区域铜最大积累约为8.56 ± 0.43% ID每克，与PAI结果一致。在后续时间点，仍可在多个器官中检测到铜，心脏、肺和肾脏等器官中仅有少量残留。这些发现表明合成的HMPDA-Cu@PAA NPs对MG63荷瘤小鼠表现出最小的有毒副作用，证明了其优异的体内生物安全性。

总结讨论部分，研究人员在结论中指出：总之，本研究开发了一种用于OS的多功能PAI引导治疗平台，能够实现协同多模式成像和PTT–CDT联合治疗。HMPDA-Cu@PAA纳米平台表现出pH响应特性、PAI能力、通过热治疗增强的催化活性、谷胱甘肽消耗功效和出色的光热性能。HMPDA-Cu@PAA纳米平台不仅通过消耗GSH产生更多有毒˙OH来增强类芬顿反应，还因其出色的光热性能实现有效的光热治疗。这在MG63荷瘤小鼠模型中实现了81.36%的显著TIR，并表现出优异的生物相容性，为OS治疗提供了一种有前景的方法。