在金属-活性荧光染料（AIEgen）框架上，通过放大组装银纳米簇修饰的超分支DNA纳米结构，实现雌激素污染物的比率荧光生物传感

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Amplified assembly of silver nanoclusters-decorated hyperbranched DNA nanostructures at metal-AIEgen frameworks for ratiometric fluorescence biosensing of estrogen pollutants

　　

吴书宇|龚梦银|尤颖颖|朱嘉欣|赖国松

中国湖北省师范大学化学与化学工程学院污染分析与再利用技术重点实验室，黄石435002

摘要

金属有机框架（MOFs）和DNA纳米结构在荧光生物传感策略构建方面展现出巨大的应用潜力。然而，如何结合它们的优势来提高荧光生物传感器的性能仍然是一个巨大的挑战。本文提出了一种新型的比率荧光生物传感策略，用于超灵敏检测17β-雌二醇（E2），该策略基于适配体识别诱导的银纳米簇（AgNCs）修饰的超分支DNA纳米结构在金属AIEgen框架（MAFs）表面的自组装，以及MAFs和AgNCs之间的荧光共振能量转移（FRET）。由于设计了多重核酸循环来放大DNA纳米结构的组装，大量的AgNCs被密集捕获在MAFs表面。MAFs与紧密捕获的AgNCs之间的高效FRET导致它们的荧光强度发生相反变化，从而实现了比率信号转导。得益于这种FRET策略的独特优势，该方法在10 fg/mL至1 ng/mL的宽线性范围内表现出优异的性能，并且E2检测的检测限低至1.2 fg/mL。除了基于完全均匀反应的简单操作性外，该方法还展示了良好的选择性、重复性和可靠性，适用于实际样品中E2的检测，显示出在现场监测微量雌激素污染物方面的巨大潜力。

引言

作为一类具有显著生态和健康风险的新兴环境污染物，类固醇雌激素（如17β-雌二醇（E2）来源多样、分布广泛，即使在微量浓度下也会对生物体造成严重的内分泌干扰[1]，[2]。因此，开发高效且便捷的E2检测方法在环境和食品样品中至关重要。尽管许多色谱-质谱技术常被视为检测雌激素污染物的金标准方法[3]，[4]，但它们通常需要繁琐的预处理程序和昂贵的仪器，因此主要适用于实验室确认分析。功能性核酸（如适配体）具有与传统抗体相当的高目标亲和力，同时成本更低、稳定性更好[5]，[6]。因此，近年来它们越来越多地被用于构建各种光学和电化学生物传感器，以开发实用的现场分析方法来检测雌激素污染物[7]，[8]，[9]。

其中，基于高度特异性适配体识别反应的荧光生物传感器特别有吸引力，因为它们不仅继承了荧光方法的高灵敏度和快速信号响应优势，还允许通过目标诱导的核酸构象变化在均匀溶液中轻松构建信号转导策略[9]，[10]，[11]，[12]。尽管已经基于各种均匀适配体识别与强大的核酸信号放大技术（如核酸酶催化或熵驱动的链循环[9]，[13]，[14]以及聚合酶依赖的链放大反应[15]，[16]）成功开发了许多高性能荧光生物传感策略，但大多数定量关系构建依赖于荧光材料的单波长信号变化。这使得分析结果容易受到外部环境因素和操作条件微小波动的影响。

为有效解决这一问题，包括我们团队在内的许多研究人员最近进行了广泛探索，开发了基于双发射信号的稳健比率荧光生物传感策略[17]，[18]，[19]，[20]，[21]。与使用单发射信号作为参考的比率策略[17]相比，基于两个目标识别相关荧光探针的相反信号变化的策略不仅提供了更好的自校准能力，还提供了更大的比率信号变化，这对于实现更宽的线性范围和更高的分析灵敏度非常有益[18]，[19]，[20]，[21]。然而，这些方法通常需要双波长激发来分别记录两个信号通道的荧光强度以构建定量关系。相比之下，通过两个信号探针之间的荧光共振能量转移（FRET）构建此类比率生物传感策略可以规避这个问题[22]，[23]。然而，除了需要供体发射光谱与受体激发光谱之间的良好重叠外，构建基于FRET的策略的主要挑战在于有效控制供体与受体之间的距离以提高FRET效率[24]。

除了传统的有机荧光染料外，各种荧光纳米材料（包括用DNA模板合成的贵金属纳米簇（例如金、银）[25]，[26]，以及具有规则多孔结构的荧光金属有机框架（MOFs）[27]）也越来越应用于生物传感。这些材料具有易于合成、低成本、优异的稳定性、良好的生物相容性、高量子产率和易于修饰等优点。在这些候选材料中，金属AIEgen框架（MAFs）通过AIE活性配体（AIEgens）与金属离子之间的配位合成[28]，[29]，[30]，已成为一种创新且有前景的荧光纳米材料类型，并引起了广泛的研究兴趣。与传统荧光MOFs不同，后者的发光来自配体本身的荧光[31]或金属离子敏化的发射[32]，MAFs表现出独特的聚集诱导发射性能。它们刚性的框架结构有效限制了AIEgens的分子内旋转和振动，从而显著提高了荧光量子产率。这些特性使MAFs成为高性能荧光生物传感信号标签的理想选择[30]。然而，缺乏合适的能量匹配受体严重限制了它们在基于FRET的生物传感系统中的应用。

幸运的是，功能性核酸的独特可编程性为这一瓶颈提供了解决方案。通过将特定的目标-适配体识别诱导的核酸结构变化与其自发的碱基配对驱动的动态自组装相结合，可以灵活构建具有明确形态特征和优异纳米限制效应的多种DNA纳米结构[15]，[33]。这不仅可以突破MAFs在基于FRET的生物传感中缺乏能量匹配受体的限制，还可以为提高生物传感器性能提供新的可能性。在这里，为了应对构建高效MAF基FRET生物传感系统的挑战，我们创新性地开发了一种新型比率荧光生物传感方法，用于超灵敏检测17β-雌二醇（E2），该方法依赖于适配体识别触发的超分支DNA纳米结构的组装，从而在MAFs表面实现银纳米簇（AgNCs）的放大负载，从而在MAFs（作为供体）和AgNCs（作为受体）之间建立稳定的FRET系统。如图1所示，传感过程由适配体识别E2启动，触发双催化发夹组装（CHA）反应形成双足DNA行走器（H1/H2/H3）。在Mg2?依赖的DNA酶（MNAzyme）行走反应的驱动下，这种DNA行走器有效切割DNA发夹H4和H5，进而启动S3-AgNCs和S4-AgNCs的放大合成。随后，这些AgNC修饰的核酸链驱动超分支DNA纳米结构在核酸修饰的MAFs表面的组装，实现AgNCs在MAFs上的放大捕获。基于MAFs和AgNCs之间的FRET导致它们的荧光信号发生相反变化，从而成功建立了比率信号转导策略。由于基于多重核酸循环的AgNC修饰超分支DNA纳米结构的放大组装以及基于FRET的比率荧光转导策略的独特优势，该方法表现出优异的分析性能和显著的实际应用价值。

章节片段

MAF/L1的制备

首先，根据已报道的方法[30]对MAFs进行了略微修改的制备。简要来说，将92 mg ZrCl?（0.395 mmol）加入到2 mL醋酸和6 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合物中。经过超声溶解后，在100°C下加热1小时，然后冷却至室温，并进一步加入23 mg（0.045 mmol）1,1,2,2-四（4-羧基苯基）乙烯（TCPE），后者已溶解在0.1 mL水中。混合物经过30分钟的超声处理后...

MAF/L1的制备和表征

本研究中使用的MAF/L1纳米复合材料是通过将带有3′-磷酸基团的L1链通过Zr–O–P配位组装到MAFs表面制备的[34]。扫描电子显微镜（SEM）表征（图2A）显示，合成的MAFs呈球形，分布相对均匀，平均尺寸约为1.17 μm，与先前的报告一致[30]。X射线粉末衍射（XRD）图谱显示了明显的特征衍射峰...

结论

在这项工作中，我们创新性地开发了一种新型比率荧光生物传感方法，用于E2的检测，该方法通过整合在MAFs上放大组装的AgNC修饰的超分支DNA纳米结构，成功突破了MAFs在基于FRET的传感中缺乏能量匹配受体的瓶颈。MAFs作为高密度固定功能性核酸的理想支架。目标识别触发的级联核酸放大使得...

CRediT作者贡献声明

龚梦银：研究、数据管理。尤颖颖：方法学、研究。吴书宇：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理。朱嘉欣：验证、研究。赖国松：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国湖北省自然科学基金（2023AFD003）、国家自然科学基金（22076043）和湖北师范大学研究项目（ZA2026001）的财政支持。

吴书宇于2023年6月从湖北师范大学获得化学学士学位。目前，她在同一大学攻读硕士学位，师从赖国松教授。她的研究兴趣集中在基于功能性核酸的生物传感器的开发上。