基于HBI的共价探针，用于特异性检测蛋白质聚集体

《Sensors and Actuators B: Chemical》：HBI-Based Covalent Probes for the Specific Detection of Protein Aggregates

　　

杨守宁|王一静|刘义德|张帅|郭瑞萌|刘金良|杨华彦

平远实验室，抗病毒药物国家重点实验室，河南师范大学药学院，中国新乡453007

摘要

蛋白质聚集是许多神经退行性疾病和细胞应激反应的标志。然而，实时监测蛋白质聚集仍然具有挑战性，主要是因为缺乏能够特异性识别聚集状态的化学探针。在这里，我们报道了一类新型的聚集响应荧光探针，这些探针基于4-羟基苯亚甲基咪唑啉酮（HBI）骨架，通过原位Michael加成反应实现对蛋白质聚集的选择性共价标记。以探针3为例，我们证明它在天然折叠或可溶性错误折叠的蛋白质存在下保持非荧光状态，但与不溶性聚集物结合时表现出明显的荧光增强，并伴有发射光的蓝移。这种共价结合通过光谱分析、SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱得到了严格验证。在活细胞实验中，探针3显示出优异的生物相容性，并且仅在蛋白酶体抑制引起的长时间蛋白毒性应激后选择性地点亮细胞内的聚集点，证实了其实时监测聚集动态的能力。我们的工作为设计能够在生理和病理条件下特异性检测和成像蛋白质聚集的共价“开启”探针提供了一种策略，为研究蛋白质稳态失衡和筛选蛋白质聚集调节剂提供了有价值的工具。

引言

蛋白质的结构与其功能密切相关[1]。然而，在环境因素、化学修饰、衰老或病原体感染的影响下，蛋白质可能会错误折叠并异常聚集——其中可溶性寡聚体和纤维的形成被广泛认为是神经毒性的关键步骤[2]。这一级联反应最终会引发一系列神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和亨廷顿病（HD），这些疾病是老年人认知衰退的常见原因[3]。因此，在细胞环境中可视化病理性蛋白质聚集对于当前的诊断和治疗具有重要意义[4]。

迄今为止，已经开发了多种技术[5]来检测蛋白质聚集，包括质谱[6]、拉曼和红外光谱技术[7]、[8]以及动态光散射（DLS）[9]等。然而，传统的检测技术往往受到操作复杂性、对高纯度样品的依赖以及有限定量能力的限制[10]。相比之下，荧光探针作为一种有前景的替代方案，因其操作简便、成本效益高和灵敏度强而受到重视。其关键优势在于设计灵活性：通过结构上的调整，探针可以针对特定分析物进行工程化设计，将分子识别转化为直观的荧光信号[11]。通过这种合理的设计，已经开发出多种非共价探针。这些探针通常通过插入淀粉样结构的分子间空间与聚集蛋白质结合，主要通过疏水相互作用和π-堆叠实现。经典的染料如Thioflavin T和Congo Red，以及更先进的咔唑和苝基衍生物都属于这一类别。虽然这些非共价探针因其简单性和荧光增强反应而被广泛用于检测淀粉样纤维，但它们通常缺乏对特定蛋白质聚集的选择性，容易受到环境干扰，并且常常无法区分可溶性寡聚体和成熟纤维——这一限制阻碍了对聚集途径的精确机制研究[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。

与非共价探针不同，共价探针与目标蛋白质形成稳定且不可逆的键，从而提供更精确和持久的聚集状态报告。为了实现这种特异性和稳定的标记，常用的策略是使用工程化的蛋白质标签，如Halo-Tag或SNAP-tag[18]、[19]。这些系统通过设计的连接化学方法，使探针与感兴趣的基因融合蛋白质（例如POI-Halo或POI-SNAP）之间实现可靠的共价结合，从而提高追踪蛋白质聚集动态的特异性和稳定性。尽管这些系统具有高特异性，对于追踪特定目标蛋白质的聚集非常有用，但它们需要基因操作，这可能较为繁琐，并可能干扰天然表达水平。更重要的是，它们仅限于工程化系统，无法用于检测未修饰细胞或组织中的内源性聚集物[20]。因此，设计具有自主、自包含的共价捕获能力的探针代表了一种重要的方法学进步。

然而，由于对蛋白质聚集内部化学反应机制的理解不完全，共价探针在检测蛋白质聚集方面的应用相对有限[21]。这一知识空白与共价蛋白质标记的化学原理相矛盾。氨基酸残基的固有亲核性，加上酶中的独特催化微环境，为设计探针和蛋白质之间的特定共价相互作用提供了坚实的化学基础[21]。在此基础上，已建立的 conjugation 策略——例如使用活化酯靶向赖氨酸残基或马来酰亚胺与半胱氨酸残基反应——使得探针可以通过1,4-Michael加成、烷基化或氨基甲酰化等反应附着[22]、[23]。然而，许多这类探针在可见光范围内发射荧光，荧光增强效果有限，或者对不溶性聚集物的选择性不足。这些观察结果强调了需要改进探针的需求，这些探针应结合无标签的共价机制、红移的荧光响应以及对不溶性聚集状态的精确选择性。

在这项研究中，我们通过对HBI骨架进行合理的功能化改造，引入二甲基氨基供体和马来酰亚胺受体，成功设计了一系列共价荧光探针，这些探针能够特异性地靶向和不溶性蛋白质聚集物。这些探针在天然折叠蛋白质存在下不显示荧光，但在遇到不溶性蛋白质聚集物时表现出明亮的荧光增强，证明它们是检测蛋白质不溶性的选择性“开启”探针。通过SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱的机制研究证实，荧光激活与聚集过程中探针和亲核残基之间的Michael加成反应同时发生。最后，我们成功应用这些探针在受压的活细胞中可视化聚集蛋白质。这项工作突显了合理分子设计在创建能够检测和区分特定蛋白质微环境的荧光探针方面的作用。

部分摘录

材料和试剂

所有试剂均从商业供应商处购买，为分析级，并未经进一步纯化直接使用。1H和13C NMR光谱是在Bruker AVANCE NEO 400光谱仪（Bruker，瑞士）上记录的，溶剂为CDCl?或DMSO-d?。高分辨率质谱（HRMS）是在Orbitrap Exploris MX LC-HRMS系统（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行的。UV-Vis吸收光谱是使用T6 New Century UV-Vis分光光度计（北京普金杰通用）获得的

分子设计

绿色荧光蛋白（GFP）因其出色的化学稳定性而在荧光标记技术中得到广泛应用。GFP的核心发色团是4-羟基苯亚甲基咪唑啉酮（HBI），其化学结构如图1a所示[24]。由于酚基本身是一个相对弱的电子供体，在错误折叠或聚集的蛋白质中，局部碱性环境（pKa ≈ 8-10）不足以使酚基脱质子[25]。因此，我们替换了

结论

总之，我们开发了一类基于HBI的荧光探针，通过共价Michael加成机制实现蛋白质聚集的特异性检测和成像。这些HBI衍生的探针采用无标签的共价机制，消除了基因融合的需要，简化了实验流程并增强了转化潜力。探针3在近红外区域发射荧光，具有更深的组织穿透能力，并且仅由不溶性聚集物激活

CRediT作者贡献声明

刘金良：撰写——审稿与编辑，实验研究。郭瑞萌：实验研究，形式分析。张帅：方法学研究。刘义德：方法学研究。杨华彦：撰写——审稿与编辑，监督，概念构思。王一静：方法学研究，数据管理。杨守宁：撰写——初稿，方法学研究，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFF0707205）的财政支持。

利益冲突声明

没有需要声明的利益冲突。

杨华彦是上海应用辐射研究所的副教授。她于2015年在复旦大学获得化学生物学博士学位，并在2015-2022年间担任河南师范大学的化学研究研究员。2020年，她被Elsevier评为“高引用中国研究员”。她的研究兴趣主要集中在开发检测蛋白质结构变化的新方法以及癌症治疗的新策略上。