无需提取步骤，采用单管法及基于Cas14a1的超高灵敏度检测技术，在新型侧向流动试纸上实现对SARS-CoV-2的检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Extraction-free, one-tube, Cas14a1-based ultrasensitive detection of SARS-CoV-2 on a novel lateral flow strip

　　

林黄|王宇|薛福来|赵彦英|郑玉才

西南民族大学畜牧兽医学院，中国四川省成都市一环路南四段16号，邮编610041

摘要

在COVID-19后遗症期间，为了进行适当的治疗并防止致命后果，迫切需要准确及时地诊断可能与其他呼吸道病毒共感染的SARS-CoV-2。现有的抗原检测方法由于自身抗体的干扰而不可靠，同时在前面的单管策略中必须投入大量努力来协调CRISPR活性和核酸扩增。本文成功开发了一种基于Cas14a1的新型单管平台SPOTS，能够无需提取样本即可特异性地可视化检测SARS-CoV-2。通过将不对称逆转录-重组酶聚合酶扩增和Cas14a1活性整合到单个试管中，并与新开发的侧向流动条结合，我们的平台达到了1.5个RNA拷贝/反应的检测限。使用最优crRNA，可以100%的特异性区分SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒。在36个临床样本上的实证应用中，其中11个样本被确定为SARS-CoV-2与甲型H1N1流感病毒、HMPV或RSV的共感染，其结果与定量PCR标准完全一致。值得注意的是，由于新型测试条上PEG介导的AuNP标记方式和抗体的巧妙设计，读数的灵敏度显著提高，假阳性也被消除。这一创新支持了对共感染样本中SARS-CoV-2的即时检测，展示了其作为特异性、超高灵敏度、简单且可视化的病原体检测平台的潜力。

引言

疫苗接种、群体免疫和抗流行病措施共同作用，使得人们对COVID-19的关注度相对降低。然而，这并不意味着SARS-CoV-2病毒已经消失。最近，新型XEC变种在美国被监测为新的疫情主角[1]，并且疫情正在向广泛地区蔓延，废水监测系统显示高病毒活性水平，这是感染激增的指标[2]。今年早些时候，中国和韩国分别报告了新的冠状病毒株HKU5-CoV-2和KUMC22-3[3]、[4]。后者与HPIV-1和鼻病毒一起感染了一名婴儿，导致肺炎并伴有暂时性的肝功能异常[5]。

SARS-CoV-2是迄今为止发现的第7种人类冠状病毒（HCoV），继HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERS-CoV之后[5]。SARS-CoV-2感染后，如果存在继发感染或其他病毒共感染，恢复情况较差[6]。实验数据显示，流感病毒和SARS-CoV-2的共感染是一个值得关注的问题，共感染的小鼠最终会发展成重症[7]。据报道，其他与SARS-CoV-2共感染的呼吸道病毒包括合胞病毒、腺病毒[8]和人偏肺病毒[9]。新的SARS-CoV-9变种以及其他呼吸道病毒的持续爆发可能会增加这些病原体与SARS-CoV-2同时感染的可能性。由于SARS-CoV-2在临床表现和传播模式上与其他呼吸道病毒有许多相似之处，因此在对可能同时感染其他呼吸道病毒的人群中筛查SARS-CoV-2极为必要，以便选择适当的治疗方案并防止疾病的致命后果。

对于COVID-19后遗症样本的检测，现有的抗原免疫测试（如金免疫层析法和酶联免疫吸附法）由于样本中的自身抗体导致严重的假阳性而变得不可靠[10]。SARS-CoV-2感染或疫苗接种显著改变了人体免疫系统[11]，通过自身免疫反应增加了自身抗体的水平，尤其是类风湿因子（主要是IgM亚型）[12]、[13]、[14]。这些类风湿因子非特异性地结合到固相载体上包被的捕获抗体的Fc段和标记抗体的Fc段，导致非特异性的假阳性信号[15]。感染或接种后样本中升高的类风湿因子增加了它们对现有抗原免疫测试的干扰，尽管这些方法具有成熟的方法、简单的操作、快速的检测和低成本等优点，但其可靠性和临床准确性大大降低。

在核酸检测方面，已经建立了多种基于CRISPR/Cas的病原体检测平台，如基于Cas12a的DETECTR[16]、HOLMES[17]和基于Cas13a的SHERLOCK[18]、[19]、HUDSON[20]。这些类似的方法将等温扩增技术整合到CRISPR/Cas12或Cas13系统中，可以快速且特异性地分析病原体样本，从而为临床诊断提供了一种简单的工具。然而，必须投入大量努力来减轻CRISPR活性对这些单管反应中扩增过程的不可避免的影响，以提高检测的可行性和灵敏度[21]、[22]、[23]、[24]。此外，这些方法通常受到目标序列中原间隔序列（PAM）位点要求的限制。此外，基于Cas13a的检测方法可能不太有前景，因为该方法使用单链RNA作为探针，而单链RNA探针容易受到普遍存在的RNases的非特异性降解[25]。相比之下，Cas14a1具有在单链DNA（ssDNA）目标序列中区分单个核苷酸的能力，从而在给定反应中提供单碱基特异性[26]。凭借这些优势，Cas14a1非常适合开发成一种灵敏且特异的CRISPR/Cas生物传感器。

在这项研究中，我们开发了一种特异性、无PAM的单管检测系统（SPOTS），用于超高灵敏度、简单且可视化的SARS-CoV-2病原体检测。我们确定了N基因的高度保守区域作为目标，以防止对突变病毒的漏检。基于Cas14a1的无PAM识别特性，自由设计了特定的crRNA，专门针对保守序列，避免与其他人类冠状病毒或呼吸道病毒的交叉反应。在我们的检测方法中，引入了长链聚乙二醇（PEG）连接器，将金纳米颗粒（AuNP）与单克隆抗体（mAb）共价结合。这种结合具有灵活的空间，使mAb能够一对一定向结合到报告探针上，由于AuNPs的有效聚集而产生敏感的着色，从而大大提高了检测灵敏度。在COVID-19后遗症时期，本研究满足了迫切的SARS-CoV-2诊断需求，以确认与其他呼吸道病原体的共感染，从而为改善公共卫生结果提供精确的治疗策略。

章节片段

结果与讨论

在COVID-19后遗症时代，准确诊断与其他呼吸道病毒共感染的SARS-CoV-2对于快速病毒传播和变异背景下的精准临床治疗是一个艰巨的挑战。在本研究中，成功建立了一种新型通用单管CRISPR/Cas14a1平台，利用无需提取的样本实现了SARS-CoV-2的可视化特异性检测。作为创新的初始核心，不对称逆转录...

结论

在本研究中，我们提出了一种名为SPOTS的策略，用于对患有呼吸道感染的个体进行超高灵敏度、特异性、简单的SARS-CoV-2病原体检测。在最佳裂解缓冲液（20mM Tris-HCl、25mM NaCl、10mM MgCl2、1mM TCEP、100μg/mL BSA，pH8.5）条件下，单管中不对称RT-RPA与CRISPR/Cas14a1的结合实现了每反应1.5个RNA拷贝的检测限。PEG介导的AuNP与anti-FAM mAb的结合...

Cas14a1蛋白的表达和纯化

Cas14a1蛋白的表达和纯化方法如前所述，并进行了轻微修改[26]。简要来说，质粒被转化到E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL感受态细胞中，然后在Terrific Broth (TB)培养基中37℃和200rpm条件下培养，直到OD600 = 0.5。通过添加0.5mM IPTG诱导转化菌株，随后在16℃和180rpm下摇动过夜。所得细胞在裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl，5%）中用匀浆器破碎。

伦理声明

涉及人类的研究得到了西南民族大学伦理委员会的批准。本研究符合当地法规和机构要求。参与者提供了书面知情同意书以参与这项研究。本手稿中未进行动物实验。

CRediT作者贡献声明

郑玉才：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、项目管理。赵彦英：监督、项目管理、资金获取、正式分析。薛福来：资源提供、项目管理、调查、数据管理。王宇：撰写 – 原稿撰写、资源提供、方法学设计、调查、数据管理。林黄：撰写 – 审稿与编辑、原稿撰写、可视化、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了西南民族大学中央高校基本研究基金（编号NOS. ZYN2023095 & ZYN2025094）的支持。我们感谢孙世超博士在Cas14a1效应核酸酶的表达和纯化方面提供的帮助。我们也非常感谢张志东教授在实验设计方面的建议。我们还要感谢王家博博士在N基因保守区域筛选方面的帮助。

林黄是西南民族大学的实验科学家。他的研究兴趣包括分子诊断、微流控技术和生殖遗传学。他在生物化学和分子生物学领域的实验设计和开发方面表现出色。