经过噬菌体改造的双金属普鲁士蓝类似物纳米酶，用于大肠杆菌O157:H7的比色检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Phage-Functionalized Bimetallic Prussian Blue Analogue Nanozyme for Colorimetric Detection of E.coli O157:H7

　　

程敏|郑一静|张桥|徐慧峰|朱曦

福建农林大学生命科学学院，中国福建省福州市350002

摘要

大肠杆菌 O157:H7是一种主要的食源性病原体，对公共卫生构成严重威胁。本文开发了一种新型比色生物传感器，通过将双金属普鲁士蓝类似物（NiFe PBA@Fe PBA）纳米酶与高特异性的噬菌体FEC14结合，实现大肠杆菌 O157:H7的快速灵敏检测。这种NiFe PBA@Fe PBA纳米酶通过原位生长法合成，表现出优异的过氧化物酶活性，在H₂O₂存在下催化TMB氧化产生可见的蓝色。噬菌体FEC14与纳米酶表面共价结合，能够特异性识别和捕获大肠杆菌 O157:H7。目标细菌在纳米酶表面的存在会导致催化活性降低，从而引起比色信号减弱。在最佳条件下，该生物传感器的检测范围为1×10¹至1×10⁷ CFU/mL，检测限低至2 CFU/mL。该传感器具有高特异性、稳定性，并在加标牛奶样本中表现出良好的回收率。这项工作为食品安全监测中病原菌的现场检测提供了一个有前景、成本低廉且易于使用的平台。

引言

大肠杆菌 O157:H7是一种主要的食源性病原体，由于其低感染剂量和高致病性，对公共卫生构成严重威胁，可导致水样腹泻、出血性结肠炎甚至危及生命的溶血性尿毒综合征。因此，快速、灵敏和特异的检测方法对于食品安全至关重要。传统的细菌培养和平板计数虽然被认为是金标准，但需要数天时间，不适合现场检测。酶联免疫吸附测定和聚合酶链反应等替代方法虽然具有更高的灵敏度和特异性，但依赖于昂贵的试剂、复杂的仪器和熟练的操作人员，限制了其在资源有限环境中的应用。

比色法因其低成本、操作简便、可视化读数和潜在的现场应用而受到越来越多的关注。然而，比色法的固有灵敏度限制需要有效的信号放大策略。天然酶（如辣根过氧化物酶（HRP）具有高催化效率，但稳定性差且成本高。因此，具有酶模拟特性的纳米酶（纳米酶）由于其更简单的合成方法、低成本和高稳定性以及易于功能化，极大地推动了比色测定的发展。在各种纳米酶中，普鲁士蓝类似物（PBAs）受到了广泛关注。PBAs是一类金属有机框架，其分子式通常表示为A^II₃[M^III(CN)₆]₂·nH₂O，其中A和M代表通过氰化物配体连接的过渡金属。PBAs在比色传感方面具有显著优势：优异的酶样活性、高无机稳定性和成本效益高的合成方法。最近，越来越多的研究致力于通过修改掺杂元素和合成方法来开发新型PBA纳米酶。将贵金属（如Au、Pt和Pd）掺入纳米酶中可以显著提高其催化性能[1]、[2]、[3]、[4]。Yuan等人[5]开发了一种Au NP修饰的中空双壳Mn-PBA纳米酶，用于血清中异烟肼的灵敏检测。涉及贵金属的掺杂策略通常成本较高且制备过程复杂，这突显了开发成本低廉且易于合成的新型纳米酶的迫切需求。

与单金属PBAs相比，双金属PBAs因其多样的活性位点、灵活的结构、高电导率和丰富的价态而受到广泛关注。Zhang[6]提出了一种还原-阳离子交换技术，用于制备具有开放纳米笼结构的异质结构Fe–Co PBAs。Lao等人[7]成功制备了一种CuFe/Fe PBA纳米复合酶，表现出优异的过氧化物酶样性能，其催化活性显著高于前体，从而实现了人表皮生长因子受体2的比色免疫测定。然而，制备具有优异病原菌检测性能的双金属PBAs仍然是一个重大挑战。

一般来说，抗体已被证明是检测病原菌的有效识别元件，免疫学方法仍然是临床诊断中的主要方法。然而，它们也存在某些局限性，包括相对较高的成本、对恶劣条件（如高温和pH变化）的敏感性以及复杂的储存或操作要求。噬菌体作为一种能够特异性识别和感染宿主细菌的病毒，具有独特的优势[8]。它们表现出高特异性和亲和力，是抗体的有前景的替代品，同时具有低成本、高稳定性、易于大规模生产和强环境抵抗力等优点[9]、[10]、[11]。这些特性使它们成为开发多种生物传感器的有希望的候选者[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。Chen的研究小组[12]利用M13噬菌体的pVIII衣壳将Au@Ag核壳纳米棒（Au@AgNR）结合，制备了一种基于M13噬菌体的SERS纳米载体，用于大肠杆菌的检测和杀灭。从医院污水中分离出的FEC14噬菌体具有直径约80纳米的二十面体头部和独特的星形尾纤维[18]。FEC14 TSP2与结合O157 O-抗原的CBA120纤维具有高度序列一致性，表明它们具有相似的宿主识别机制。它对大肠杆菌 O157:H7表现出高特异性和强裂解活性。因此，它被认为是大肠杆菌 O157:H7的理想生物识别元件。

在本研究中，通过原位生长法制备了一种具有边缘选择性Fe PBA沉积的核壳纳米酶（NiFe PBA@Fe PBA）。由于Ni²⁺/Ni³⁺和Fe²⁺/Fe³⁺氧化还原对在核壳界面处的空间接近性，这种纳米酶表现出优异的过氧化物酶活性，在H₂O₂存在下催化TMB氧化产生可见的蓝色。系统表征揭示了结构-活性之间的明确关系：核壳界面的形成是催化性能显著提高的关键。利用这一特性，通过将高特异性的噬菌体FEC14与纳米酶表面结合，开发了一种基于比色的噬菌体生物传感器来检测大肠杆菌 O157:H7。检测原理如图1所示。首先，通过对纳米酶进行胺化修饰并将其与噬菌体FEC14结合（如图1A所示），成功制备了FEC14@NiFe PBA@Fe PBA复合体。利用噬菌体FEC14对目标细菌的特异性识别和捕获能力，大肠杆菌 O157:H7可以被捕获到NiFe PBA@Fe PBA的表面。由于大肠杆菌 O157:H7在NiFe PBA@Fe PBA表面的富集，纳米酶的催化活性减弱，从而导致TMB氧化产物的颜色变浅。基于这一原理，构建了一种用于检测大肠杆菌 O157:H7的比色传感平台。该检测方法具有以下显著优势：1）原位合成方法丰富了纳米酶的催化活性位点，使其具有优于辣根过氧化物酶的催化性能；2）噬菌体FEC14对目标细菌大肠杆菌 O157:H7表现出优异的选择性和特异性；3）构建的比色传感平台结合了操作简单和高灵敏度的特点。这些优势使得该传感平台能够应用于复杂基质中的大肠杆菌 O157:H7检测，显示出在病原菌检测领域的巨大应用潜力。

章节片段

材料和试剂

LB肉汤和LA琼脂从Hi-Tech Park Haibo Biotechnology Co., Ltd.（中国青岛）购买。K₃[Fe(CN)₆}、Ni(NO₃)₂·6H₂O、C₆H₅Na₃O₇·2H₂O、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）从Sinopharm Chemical Reagent Co Ltd.（中国上海）购买。噬菌体FEC14由吉林大学提供。

大肠杆菌 O157:H7的培养

大肠杆菌 O157:H7在溶源性肉汤培养基中以1%的接种量在37°C下培养18小时。然后，上述细菌

NiFe PBA@Fe PBA和FEC14@NiFe PBA@Fe PBA的表征

首先在室温下通过共沉淀法合成了作为核心的NiFe PBA。接下来，在NiFe PBA表面生长Fe PBA，得到核壳结构NiFe PBA@Fe PBA。从TEM（图1A和B）可以看出，NiFe PBA@Fe PBA呈现立方结构，且Fe PBA薄层沉积在规则的立方NiFe PBA边缘。元素分布图（图1D、E、F和G）显示C、N、Ni和Fe原子均匀分布。

结论

总之，我们通过将噬菌体FEC14与NiFe PBA@Fe PBA纳米酶结合，开发了一种高灵敏度和特异性的比色生物传感器。该检测方法基于目标细菌抑制纳米酶过氧化物酶活性的原理，为病原体检测提供了一个快速、低成本且可靠的平台，在食品安全的实际应用中显示出巨大潜力。

CRediT作者贡献声明

朱曦：撰写 – 审稿与编辑，监督。郑一静：方法学，数据管理。程敏：撰写 – 原稿，方法学，研究，数据管理。徐慧峰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，方法学。张桥：数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

该项目得到了国家自然科学基金（81773894）和福建省自然科学基金（2023J01152）的财政支持。作者还感谢吉林大学基础医学院病原生物学系的赵春燕博士。