综述：基于纸质微流控芯片的核酸检测：从扩增到信号读取

《Talanta》：Nucleic Acid Detection using Paper-Based Microfluidic Chips: From Amplification to Signal Readout

　　贾轩星|陈莉|方杨
教育部分子酶学与工程重点实验室，吉林大学生命科学学院，长春130012，中国

**摘要**
基于纸张的微流控技术已成为一种有前景的核酸检测分析平台，其在低成本、高集成度和可扩展性方面具有优势，适用于分子诊断。得益于纸张基材的天然多孔结构和毛细驱动的流动特性，这些平台在检测时间短、便携性强、使用便捷以及成本效益等方面表现出竞争力。本文系统总结了基于纸张的微流控核酸检测的最新进展，遵循“扩增策略-信号增强-信号读取”的核心框架进行讨论。在扩增方面，讨论了等温扩增方法（如LAMP和RPA）以及CRISPR辅助系统在基于纸张的平台上的应用和性能。在信号增强方面，重点介绍了催化发夹组装（CHA）、金纳米材料和纳米酶催化等策略在提高灵敏度方面的作用。在信号读取方面，比较分析了电化学、比色法、荧光法和表面增强拉曼散射（SERS）等多种检测方式在适应性和发展趋势上的差异。本文总结了该领域的最新进展，指出了其优势和局限性，并提出了优化和转化应用的未来方向，为微流控领域的研究人员和工程师提供了概述，同时也为临床医生和科学家在诊断领域提供了新的技术途径。

**引言**
核酸检测在现代诊断中发挥着关键作用，能够高度特异性地识别与疾病相关的遗传信息，适用于多种临床场景。循环游离DNA（cfDNA）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、微RNA（miRNA）等核酸生物标志物在癌症和传染病等病理状态下表现出特定的表达变化，使其成为液体活检和精准医学研究的热点[1]。在传染病中，它支持早期病原体筛查、疫情监测和治疗指导；在非传染性疾病中，尤其是在癌症和糖尿病的长期管理中，基于分子和生物标志物的分析对于早期风险分层、疾病监测和个性化干预越来越重要[3][4]。目前，聚合酶链反应（PCR）被广泛用于核酸的扩增和检测，是该领域的“金标准”，通过高效的热循环实现目标核酸序列的指数级扩增，具有极高的灵敏度和特异性[5]。然而，其对精密热循环仪和标准实验室环境的依赖限制了其在现场、初级医疗和资源有限地区的应用[6]。为克服PCR技术的这些局限性，研究人员提出了等温扩增技术，如环介导的等温扩增（LAMP）[7]和重组酶聚合酶扩增（RPA）[6]，这些方法无需热循环，可在恒定温度下完成核酸扩增，显著降低了检测设备的要求并提高了现场适应性。然而，等温扩增在特异性控制方面仍存在局限性，常导致非特异性扩增和假阳性，从而影响检测准确性[9]。同时，CRISPR/Cas系统因其高序列特异性、目标识别和切割能力而被迅速应用于核酸检测系统，它通过crRNA引导Cas蛋白精确切割目标序列，显著提高了检测的选择性[10]。CRISPR/Cas系统是一种原核生物的适应性免疫机制[11]，其中引导RNA指导Cas蛋白特异性识别和切割外来核酸[12][13]，从而抵御噬菌体等入侵遗传元件。近年来，由于其高靶向特异性和易用性，CRISPR/Cas系统被广泛应用于基因组编辑、转录调控和核酸检测等领域[14][15][16]。CRISPR-Cas9[14]和Cas12a[15]系统主要识别和靶向双链DNA序列，而Cas12a在目标激活时对单链DNA具有非特异性核酸酶活性；Cas13a[16]系统则特异性识别单链RNA目标并触发单链RNA核酸酶活性。不过，CRISPR系统本身通常需要预先扩增目标序列，单独使用时难以在资源匮乏的环境中快速完成检测任务。为解决这一问题，研究人员将CRISPR/Cas系统与等温扩增技术（如LAMP、RPA等）[17]或催化发夹组装反应（CHA）等信号放大策略结合，形成了集快速扩增与精确识别于一体的多模块核酸检测方案[18]。这些组合策略不仅显著提高了检测灵敏度和特异性，还显著缩短了检测时间。当与简化操作流程的便携式平台系统结合使用时，特别适合现场检测核酸生物标志物，为便携式核酸检测平台奠定了基础[19]。因此，最新的核酸检测进展越来越依赖于将扩增化学与生物传感和信号转导模块相结合[20]。CRISPR辅助识别[10]、催化发夹组装、纳米颗粒介导的增强、纳米酶催化及相关信号放大策略提高了检测灵敏度和选择性，而比色法、荧光法、电化学法、紫外-可见光（UV-vis）[21]和表面增强拉曼散射读数法扩展了定性和定量分析的途径。这类集成生物传感系统在需要快速响应、视觉解释或对复杂仪器依赖性低的场景中尤为有价值[22]。

微流控技术作为一种近年来迅速发展的分析平台，为核酸检测提供了理想的条件，具有高通量、自动化和微型化的特点[23]。通过精确控制微量液体，微流控系统可以整合多个反应步骤，包括样品预处理、扩增、识别和信号读取，显著提高了检测效率和系统集成度[24]。然而，传统的微流控芯片主要使用硅、玻璃或聚合物基材，存在设备操作复杂、成本高、生产过程复杂和环境适应性差等实际瓶颈[25]。为了实现更经济高效和便携的现场应用，出现了基于纸张的微流控分析设备（μPADs）。这种平台利用纸张的自然多孔性和毛细作用实现液体驱动功能，纸张的多孔结构不仅提供液体通道，还作为反应基底携带试剂，支持多步骤反应和信号输出[26]。它无需外部能源，自驱动运行，环保且易于大规模生产。此外，纸张的可生物降解性和环保性使其特别适合一次性使用，有助于降低交叉污染风险和减轻废物处理压力，成为即时检测（POCT）领域极具前景的新平台[27][28]。它在医学诊断、食品安全[29]和环境监测等多个领域展现出广泛的应用前景，并具有巨大的发展潜力[30]，尤其是在资源受限地区[31]。值得注意的是，基于纸张的微流控技术已在非传染性疾病管理中展现出转化应用价值。在肿瘤学研究中，纸张平台被用于分析癌症相关生物标志物[3]，包括微RNA、外泌体核酸等液体活检相关目标，显示出其在早期筛查和动态监测方面的潜力；在糖尿病研究中，基于纸张的微流控设备在低成本葡萄糖分析和分散式代谢评估中显示出实际价值，进一步证实了纸张平台适用于慢性疾病的POCT[4][32]。这些发展加强了将基于纸张的微流控技术扩展到更集成化的核酸检测系统的合理性。

现有的一些综述分别讨论了等温扩增、CRISPR诊断、生物传感器或微流控设备；关于基于纸张的核酸分析作为一个完整工作流程的文献仍相对分散。特别是，需要一个集中的讨论，将平台材料、设备格式与扩增策略、信号增强方法和多模态读数方法结合在一个基于纸张的分析框架中。这一视角很重要，因为基于纸张的核酸检测的实际性能不仅取决于单一模块，还取决于样品处理、反应化学、信号转换和设备架构的协调设计。本文重点介绍基于纸张的微流控芯片的核酸检测，从扩增到信号读取的整个过程。首先概述了基于纸张的微流控平台的结构特性和制造逻辑，然后讨论了在这些基材上使用的主要核酸扩增方法，特别强调了等温策略在即时检测（POCT）中的实际优势[33]。进一步探讨了提高分析灵敏度、特异性和可用性的代表性信号放大方法和读数模式，并强调了它们在传染性和非传染性背景下的应用[34]。通过这种组织方式，本文旨在阐明基于纸张的核酸检测系统的设计逻辑、技术优势和剩余挑战，为未来的平台开发和临床转化提供更连贯的基础[35]。

**部分摘录**
**基于纸张的微流控技术**
传统的基于刚性基材（如玻璃和硅）[56]和聚合物材料（如塑料和PDMS）[57][58]的微流控平台具有高精度和可控性，但往往存在制造复杂、成本高和便携性有限的问题，这推动了基于纸张的微流控技术作为低成本和易于获取的替代方案的发展。基于纸张的微流控技术利用纸张的多孔结构和毛细作用实现……

**扩增**
目前，基于纸张的微流控技术的核酸检测方法通常采用等温扩增，主要是因为它能够在恒定温度下快速高效地扩增，无需复杂的热循环设备[71]。等温扩增技术通过酶介导的链置换反应或引物导向扩增在恒定温度下高效复制DNA或RNA。与PCR相比，这种策略不需要……

**催化发夹组装（CHA）**
CHA是一种非酶促的等温信号放大策略。与LAMP或RPA等扩增技术不同，CHA不直接扩增核酸拷贝数[83]。相反，它利用DNA自组装原理，使用专门设计的发夹探针，在目标核酸的催化作用下发生构象变化，驱动连续的催化循环来放大特定核酸序列的信号。在此过程中，目标……

**信号检测**
在基于纸张的微流控核酸检测系统中，信号检测模块是生成分析结果的关键组成部分，直接影响系统的灵敏度、准确性和适用性。无论采用何种扩增或信号放大策略，目标核酸的存在和浓度最终必须通过可视化的、可测量的信号来确定。近年来，随着纳米材料、智能设备的发展……

**讨论**
基于纸张的微流控核酸检测技术的主要优势在于其低成本、便携性和无需复杂仪器。通过将LAMP和RPA等等温扩增方法与CHA、金纳米颗粒和纳米催化剂等信号放大策略相结合，该平台有效减少了传统核酸检测对昂贵设备和专业实验室的依赖。因此，它特别适合……

**作者贡献声明**
陈莉：概念化、研究、监督、可视化、撰写——审稿与编辑。
方杨：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、概念化。
贾轩星：撰写——初稿、研究、数据分析。

**利益冲突声明**
作者声明没有财务或商业利益冲突。

**致谢**
本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。