利用针对OmpA的单克隆抗体对海鲜样本中的副溶血性弧菌进行血清型交叉鉴定

《Talanta》：Cross-serotype Identification of Vibrio parahaemolyticus in Seafood Samples by OmpA-targeting Monoclonal Antibodies

朱文涛|邱俊杰|Steven Suryoprabowo|胡安拓|王文斌|刘立强

中国江苏省海洋大学海洋生物资源与环境重点实验室，连云港市，222005，江苏

摘要：

快速检测海产品中的多种副溶血性弧菌血清型需要简单可靠的免疫测定方法。我们之前的表面蛋白质组学筛选发现外膜蛋白A（OmpA）是一种高度丰富且易于获取的表面抗原。在此，我们制备了针对OmpA的单克隆抗体（mAbs）（VPA1186），并利用它们开发了双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA）和侧向流动免疫测定法（LFIA）。在12种mAbs中，6D11和12B1作为抗体对使用时表现出优异的结合亲和力（3.11-8.17 × 10⁹）和较高的阳性与阴性比率（> 20）。值得注意的是，捕获抗体6D11对副溶血性弧菌具有高特异性，而12B1在弧菌属内表现出较广的交叉反应性；这种抗体对的“桶效应”决定了该方法的高特异性。优化的DAS-ELISA在多种副溶血性弧菌血清型（6/6）和菌株（9/9）中实现了最低检测限（LODs）为1.37 × 10⁴ CFU/mL，而LFIA在加标样品中的视觉LOD约为10⁵ CFU/g，在6小时富集后为10 CFU/g。ELISA和LFIA对副溶血性弧菌的特异性很高（93.10%，27/29菌株）。在实际海产品样本分析中，该方法与PCR和基于培养的方法的一致性很高（95.5%，21/22样本）。通过靶向暴露在表面的、丰富的、保守的OmpA抗原，本研究建立了一种针对大型水产品中副溶血性弧菌的特异性跨血清型检测策略。

引言

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性、嗜盐性的动物源性细菌，广泛存在于鱼类、虾类和贝类等海洋生物中；它与急性肝胰腺坏死疾病有关，给全球虾类养殖业造成了重大损失（Kumar等人，2021年）。副溶血性弧菌也是食源性疾病的主要原因，给全球公共卫生带来了负担（Prithvisagar等人，2023年）。具体来说，食用未煮熟的海产品或交叉污染的食物可能导致急性胃肠炎，在严重情况下还会导致败血症（Song等人，2025年；Zhang等人，2025年）。美国疾病控制与预防中心估计每年约有80,000例弧菌病病例，其中副溶血性弧菌是主要病原体（Brumfield等人，2025年）。最近的一项欧盟风险评估表明，全球变暖导致夏季欧洲沿海地区的弧菌检出率上升（Koutsoumanis等人，2024年）。2021年至2022年间，澳大利亚因牡蛎爆发了副溶血性弧菌疫情，导致268例病例（Fearnley等人，2024年）。在中国，2010年至2020年间报告了1,772起涉及副溶血性弧菌的疫情和超过27,000例病例（Wu等人，2024b）。包括日本和东南亚在内的其他高负担地区也持续报告局部疫情（Muzembo等人，2024年）。

传统的副溶血性弧菌检测方法，包括基于培养的方法和基于核酸的检测方法，在时间、便利性、通量和现场适用性方面存在局限性（Foddai & Grant，2020年）。免疫测定方法如酶联免疫吸附测定法（ELISA）和侧向流动免疫测定法（LFIA）具有快速、低成本和设备依赖性低的优点，并已成功应用于其他食源性病原体（Duan等人，2021年；Ren等人，2022年；Mahari等人，2023年）。然而，由于缺乏高度丰富、物种特异性的表面抗原以及复杂海产品基质的干扰，副溶血性弧菌的免疫测定仍面临灵敏度和特异性有限的挑战（Li等人，2025b）。迄今为止，大多数报道的免疫测定方法依赖于三种次优策略。第一种方法针对热稳定的直接溶血素（TDH）或TDH相关溶血素（TRH），可以检测到产生毒素的活菌株，但无法检测到缺乏这些毒素的TDH或TRH阴性菌株（Kumar等人，2011年）。第二种方法使用针对全细胞抗原的单克隆抗体（mAbs），但由于脂多糖（LPS）和荚膜多糖（CPS）的高度多态性，常常存在血清型特异性问题（Prompamorn等人，2013年）。第三种方法针对毒力相关蛋白如Pir毒素和LppQ87G48，分别显示出有限的通用性和不足的检测灵敏度（Yonekita等人，2020年；Dong等人，2024年）。基于商业多克隆抗体和mAb的免疫磁分离-LFIA系统在富集步骤后实现了较低的检测限（LODs）（10 CFU/mL），但未评估抗体和方法的特异性（Zhou等人，2020年）。最近，纳米材料辅助的流动生物传感器在其他细菌病原体的检测灵敏度和便携性方面显示出显著改进（Huang等人，2026年；Huang等人，2025年）。尽管如此，这些先进平台尚未解决副溶血性弧菌跨血清型检测的具体挑战。这些结果强调了迫切需要一种快速、灵敏且特异的免疫测定方法来检测多种副溶血性弧菌血清型和来源。

副溶血性弧菌的外膜蛋白A（OmpA）是主要的外膜蛋白，参与调节渗透压。它高度表达，并通过控制小分子的通透性提高了细菌对抗生素的抵抗力，使其成为潜在的亚单位疫苗候选物（Paria等人，2021年；Singh & Kodgire，2024年）。我们的比较基因组学和表面蛋白质组学分析确定了三种OmpA作为副溶血性弧菌的差异性OMP，表明其作为可靠免疫诊断标志物的潜力（Wang等人，2021年）。值得注意的是，OmpA在各种环境条件下都高度暴露在表面（Liu等人，2022年）。免疫学研究表明，重组OmpA和混合OmpA在小鼠中引发了强烈的体液反应，并对副溶血性弧菌、藻解弧菌和斑马鱼中的迟钝爱德华氏菌提供了部分保护性免疫（Li等人，2016年；Zhang等人，2020年）。尽管取得了这些进展，但很少有研究开发基于OmpA mAb的副溶血性弧菌检测免疫测定方法。

本研究旨在表达、纯化并评估三种副溶血性弧菌的重组OmpA蛋白，以制备高亲和力的特异性mAb。整个工作流程如图1所示。简而言之，通过免疫小鼠评估了三种重组OmpA抗原的免疫原性；然后选择用OmpA VPA1186免疫的小鼠，这些小鼠产生了最高的抗体滴度和最广泛的弧菌交叉反应性，用于细胞融合并制备12种高亲和力mAb。通过对144种抗体配对进行棋盘式筛选，确定了最佳组合，并随后用于建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA）和基于胶体金的LFIA。使用38种菌株和22种不同商业食品样本（包括新鲜海产品、酱料和煮熟的水产品）的纯培养物验证了所建立方法的灵敏度、特异性和可靠性。

部分摘录

细菌菌株

如表S1所列，本研究共使用了38种细菌菌株，包括9种副溶血性弧菌菌株、17种其他弧菌物种（如坎贝尔弧菌）和12种非弧菌菌株（如大肠杆菌）。所有菌株均接种到溶原质肉汤（LB）琼脂中，单个菌落接种到LB肉汤中并在37°C下过夜培养。

重组OmpA蛋白的构建、表达和纯化

从副溶血性弧菌菌株的基因组DNA中扩增了对应于旧位点标签VP0764、VPA0248和VPA1186的OmpA基因

使用副溶血性弧菌 CICC 21618的基因组DNA作为模板，成功扩增了三个OmpA基因VP0764（977 bp）、VPA0248（991 bp）；VPA1186（997 bp），得到了清晰的条带（图1a）。通过双酶消化验证（图1b）显示两条清晰的条带（第3、5和7行），分别对应于空白pET-32a载体（超过5000 bp，第1行）和OmpA基因（约1000 bp，第2、4和6行）。进一步使用T7引物进行测序

结论

本研究确定并验证了OmpA是一种暴露在表面、丰富、保守且具有免疫原性的抗原，并成功开发了针对副溶血性弧菌的跨血清型和特异性mAb及免疫测定方法。使用高亲和力mAb 6D11和12B1建立的双抗体夹心ELISA和LFIA能够检测到异质性的副溶血性弧菌菌株（9/9），灵敏度合理（约10⁵ CFU/mL），与其他测试菌株的特异性高（2/29），并且一致性达到95.5%（21/22）

刘立强：可视化、监督、方法学、概念化。王文斌：写作——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。胡安拓：写作——审阅与编辑、形式分析、数据管理。Steven Suryoprabowo：写作——审阅与编辑、方法学。邱俊杰：写作——初稿、方法学、调查、形式分析、数据管理。朱文涛：写作——初稿、可视化、验证、数据管理

Foddai和Grant，2020年；Wang等人，2021年。

数据可用性

数据可根据请求提供。

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：32172284）、江苏省博士后研究计划资金（2021K316C）和连云港市博士后研究计划（LYG20210001）的支持。作者衷心感谢南京农业大学的Bie Xiaomei教授提供用于本研究的12种测试菌株。