在即时等温核酸检测中，通过序列验证的触发机制来实现假阳性控制

《Talanta》：Sequence-validated trigger gating for false-positive control in point-of-care isothermal nucleic acid detection

　　

作者：Gulinaizhaer Abudushalamu、Chuankun Yang、Yunpeng Jiang、Xiong Ding、Guoqiu Wu

单位：东南大学医学院中大医院临床实验室医学中心，中国江苏省南京市210009

摘要

在等温扩增过程中产生的非特异性副产物可能会被下游信号放大器放大，导致假阳性结果，从而限制了即时核酸检测的可靠性。本文报道了一种基于序列验证的触发门控策略，用于催化发夹组装（CHA），以提高等温可视化RNA检测中的假阳性控制能力。在该设计中，上游扩增产物必须经过序列依赖性验证后，才能释放激活熵驱动的CHA所需的触发链，从而限制非特异性扩增产物进入下游信号放大过程。以严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）RNA作为模型目标，我们将这一概念应用于一个与侧向流动读数系统耦合的调控催化发夹组装平台（RecHA）中。该检测方法降低了背景激活，提高了检测线的区分度，可在34°C下运行，并支持直接加载裂解产物。RecHA能够检测低至10 fM的SFTSV RNA。在70个qRT-PCR阳性血清样本和30个阴性对照样本的临床验证中，其AUC为0.994，灵敏度为1.000，特异性为0.967，与qRT-PCR结果高度一致。基于序列验证的触发门控机制提高了基于CHA的可视化RNA检测的选择性和可靠性，为资源有限的场景提供了实用的分子诊断策略。

引言

视觉和即时诊断生物传感技术已经取得了显著进展

然而，在等温可视化核酸检测中，一个核心挑战在于缺乏对哪些上游扩增产物能够激活下游信号生成的控制

上游扩增可能产生正确扩增的目标、部分匹配的延伸产物、引物衍生的假象以及残留引物

当这些无效的分子物种转移到下游读数模块时，它们可能与真正的目标信号一起转化为可见输出

即使便携式诊断平台和信号转导策略不断进化，这一挑战仍然存在

因此，对于即时等温检测而言，关键要求不仅仅是高效的扩增，还包括在信号转导之前对扩增产物的选择性筛选

重组酶聚合酶扩增（RPA）因其在温和条件下能快速生成高拷贝数产物而被广泛用于便携式核酸检测

然而，这种高增益扩增也会产生序列保真度不一的异质性产物池

在大多数当前的检测设计中，这个产物池被视为下游解码的功能等效输入

因此，下游模块不仅继承了扩增的目标信息，还继承了扩增产生的分子噪声，这可能会提高背景信号并影响视觉区分度

为了提高序列选择性，RPA通常与CRISPR–Cas系统结合使用，后者在信号输出前提供酶促目标验证

尽管有效，但这些系统依赖于蛋白质效应器和额外的生化依赖性，可能会使存储、工作流程和现场部署变得复杂

无酶催化发夹组装（CHA）提供了一个有吸引力的替代方案，因为它是由熵驱动的，操作简单，并且易于与侧向流动读数系统集成

然而，在大多数报道的RPA–CHA格式中，CHA位于扩增过程的下游，没有明确的序列验证步骤；整个RPA产物池直接用于触发链置换扩增

这种架构限制表明，RPA–CHA系统中的关键未满足需求不仅仅是更强的扩增或更低的背景噪声，而是一种在上游扩增和下游信号转导之间进行序列验证的门控机制

这些限制表明，核心挑战不仅仅是提高扩增效率或添加另一个下游放大器，而是控制哪些上游产物能够进入信号放大过程

在该设计中，扩增产物首先被处理成单链目标候选物，然后只有当上游产物满足所需的序列身份时，才会释放触发链，从而启动熵驱动的CHA并产生视觉输出

我们在一个称为调控催化发夹组装（RecHA）的平台上实现了这一概念

我们使用严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）RNA作为模型RNA目标来评估这一策略的实际效用

在这种背景下，我们在接近室温的等温条件下，使用直接裂解物输入和侧向流动可视化读数系统测试了RecHA，并将其性能与传统方法进行了比较，以评估其在复杂临床样本中的分析区分度和诊断可靠性

章节片段

材料和试剂

本研究使用的所有材料和化学试剂列在补充材料S1中

探针序列设计和计算机模拟验证使用NUPACK网络服务器进行

保持稳定性ΔGtoehold = ?9至?5 kcal·mol^-1

序列验证的触发释放

优化结果显示，在34°C下，每种引物浓度为0.8 μM时，RT–RPA的扩增效率最高，时间为25分钟

RecHA能够从血清中高度敏感、高度特异性地检测SFTSV RNA，其结果与参考标准qRT-PCR高度一致

在Youden指数确定的临界值下，灵敏度、特异性和总体准确率分别为1.000、0.967和0.990，假阳性率为0.033，没有假阴性结果

结论

在接近室温（34°C）的等温条件下，使用直接裂解物输入，该平台对血清中SFTSV RNA的检测限（LoD）达到10 fM，并在临床样本中展示了接近qRT-PCR的诊断性能

CRediT作者贡献声明

Gulinaizhaer Abudushalamu：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化Chuankun Yang：验证、方法学、研究、概念化Yunpeng Jiang：可视化、监督、数据管理Xiong Ding：监督、项目管理、正式分析Guoqiu Wu：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取

利益冲突

本研究遵循赫尔辛基宣言和相关国家指南进行

由于本研究基于匿名化的临床剩余样本和常规收集的临床数据，伦理委员会免除了书面知情同意的要求

出版同意

部分内容可以在补充材料中找到

资金声明

国家自然科学基金（82373781）、江苏省医学重点学科（实验室）培养单位（JSDW202240）、江苏省重症医学重点实验室（JSKLCCM202202015）、

江苏省卫生健康委员会预防医学研究项目（Y12023054）的支持

利益冲突声明

本研究得到了东南大学附属中大医院实验室部门的宝贵支持