《Ticks and Tick-borne Diseases》：Seasonality and environmental drivers of tick-borne encephalitis virus prevalence in Ixodes ricinus ticks from Southern Norway
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蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）是导致人类神经系统疾病的病原体，在西欧主要由蓖子硬蜱（Ixodes ricinus）传播。在挪威，以往的监测研究已沿着海岸线从北部的诺尔兰郡（Nordland County）
蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）是导致人类神经系统疾病的病原体，在西欧主要由蓖子硬蜱（Ixodes ricinus）传播。在挪威，以往的监测研究已沿着海岸线从北部的诺尔兰郡（Nordland County）检测到该病毒，南至东南部的瑞典边境，然而所有人类的蜱传脑炎（Tick-borne encephalitis, TBE）病例均局限于该国最南端，且近几十年来发病率显著上升。TBEV的发病率和流行率（Prevalence）始终与气候因素相关。研究人员评估了六年期间挪威南部TBEV流行区Mandal地点的若虫和成蜱中TBEV流行率的月度变化，此外还评估了病毒流行率与积温和相对湿度之间的关系。观察到了明显的病毒流行率季节性：若虫在春末夏初达到峰值，成蜱在夏季至初秋达到峰值。积温与若虫和成蜱的流行率呈正相关，相对湿度与成蜱的流行率呈负相关。未来的研究应侧重于了解宿主动态、气候变化和土地利用对该新兴病毒在挪威循环的影响。
研究背景与意义
蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）是蜱传脑炎（Tick-borne encephalitis, TBE）的病原，TBE是欧洲最常见的虫媒病毒病，可导致人类及其他哺乳动物的神经系统疾病。人类主要通过蜱虫叮咬感染该病毒，少数情况下也可通过食用未高温消毒的乳制品经食物传播感染。TBEV属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Orthoflavivirus），目前已描述五个亚型：欧洲亚型（TBEV-Eu）、西伯利亚亚型（TBEV-Sib）、远东亚型（TBEV-Fe）、喜马拉雅亚型（TBEV-Him）和贝加尔亚型（TBEV-Bkl）。在中欧、西欧和北欧，目前仅报告TBEV-Eu，其病死率约为2%，而TBEV-Fe和TBEV-Sib的死亡率分别约为8%和高达40%。
在西欧，TBEV-Eu的主要传播媒介是蓖子硬蜱（Ixodes ricinus）。该病毒在自然界于蜱虫和啮齿动物（如Apodemus spp.和Myodes glareolus）之间循环，这些啮齿动物是不成熟蜱虫的常见宿主，并可产生病毒血症感染。蜱虫可通过吸食病毒血症宿主的血液以及通过共饲喂（即感染的蜱虫与未感染的蜱虫在同一宿主上近距离取食）获得病毒。此外，还存在经卵传递（Transovarian transmission）和经蜕皮传递（Transstadial transmission）。人类最常因感染若虫的叮咬而感染，因为若虫生命周期阶段导致了大多数人类蜱虫叮咬事件。挪威若虫蓖子硬蜱中TBEV的平均池流行率（Estimated pool prevalence, EPP）为0.3%（范围0至3.5%），成蜱中上升至4.3%（范围0至20.6%）。
挪威的监测研究已在从北部诺尔兰郡到东南部瑞典边境海岸线的蜱虫和有蹄类动物中检测到该病毒。尽管如此，所有的TBE人类病例都局限于该国最南部的布斯克鲁德（Buskerud）、东福尔（?stfold）、西福尔（Vestfold）、泰勒马克（Telemark）和阿格德尔（Agder）郡；病例数从1994–2011年间的80例激增至2022年一年的84例。此前挪威的蜱虫监测研究多集中于在单一时间点（通常在春季、夏季或秋季）评估多个地点的TBEV存在和流行率。然而，关于蜱虫中病毒流行率年度和季节变化的科学文献在欧洲较为稀缺，在挪威则完全空白。不同地区的季节模式各异，例如德国巴伐利亚和黑森林观察到年际变化但无季节变化，而另一些研究则发现季节性变化大于年际变化，法国阿尔萨斯则同时存在年和季节变化。
TBEV的流行率预计会受到温度和湿度等微气候变量的季节性影响。例如，较温暖的 conditions 可通过增加病毒复制来提高感染蜱体内的病毒载量。实验研究表明，高温和低湿度暴露后，蜱虫中的病毒检测率和/或病毒滴度会降低。此外，蜱的生理年龄等因素也会影响病毒载量，进而影响不同季节流行率的估计。宏观生态变量，如啮齿动物等合格宿主的可用性及其营养状态，或鹿等不合格宿主的可用性，将通过共饲喂直接影响TBEV的传播，从而影响年际流行率。基于此，研究人员开展了此项研究，旨在了解TBEV在蜱种群内的流行率如何变化。该研究评估了2017–2022年间挪威南部TBEV流行区Mandal的若虫和成蜱中TBEV流行率的月度变化，这是挪威首项多年份月度评估蜱虫TBEV流行率的研究。此外，研究人员分析了温度和湿度变化对流行率变异的可能影响，并讨论了促进这种变异的其他可能变量。该研究发表于《Ticks and Tick-borne Diseases》。
主要关键技术方法
研究人员于2017年至2022年在挪威南部Mandal（58°00′28″N; 07°30′22″E）的混交林地带进行蜱虫采集，采用拖布/旗布法（dragging/flagging）每月采集游离蜱（questing ticks），雨天或雪天停止采集。每次采集至少收集740只若虫（10只为一池）及相应数量的成蜱。样本经低温运输和保存后，使用MP FastPrep-24珠磨均质器匀浆，通过RNeasy Mini Kit提取RNA，并利用High-Capacity反转录试剂盒合成cDNA。TBEV检测采用针对TBEV E基因3′端54 bp片段的实时荧光定量PCR（real-time PCR），阳性产物使用Pyromark Q48系统进行焦磷酸测序（pyrosequencing）确认。数据统计方面，若虫流行率计算采用估计池流行率（EPP）和最小感染率（Minimum infection rate, MIR），成蜱采用二项分布精确置信区间。使用R 4.4.2软件进行统计分析，包括Exact Binomial Test，并构建广义线性混合模型（Generalized linear mixed models, GLMMs）和广义线性模型（Generalized linear model, GLM）来分析积温（Heat sum，即高于5°C的生长积温日数）和最低相对湿度（min RH）与TBEV流行率的关系，年份作为随机效应，模型选择基于赤池信息准则（Akaike Information Criterion, AIC）。
研究结果
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Introduction（引言）
引言部分阐述了TBEV的病原学特征、主要媒介蓖子硬蜱的生态及传播循环机制（包括共饲喂和经蜕皮传递），指出了挪威TBE人类病例的地域局限性及近年的激增现状。同时，回顾了欧洲及挪威先前监测研究的局限，即多为单点季节性采样，缺乏长期的月度动态数据，并提出了微气候（温度、湿度）及宿主动态可能对TBEV流行率产生影响的假设，从而引出本研究的目的。
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Methods（方法）
详细描述了蜱虫采集的地点（Mandal，海拔20–50 m，距海50–200 m，北向山坡混交林）、时间跨度（2017–2022各月，天气允许情况下）及样本量（每月至少740只若虫，成蜱配套采集）。说明了样本处理流程：个体成蜱或10只若虫一池，于-80°C保存，均质化后提取RNA并合成cDNA。明确了TBEV的检测方案：real-time PCR靶向E基因54 bp片段，阳性标本经焦磷酸测序验证。统计方法包括使用Epitools计算EPP和MIR，二项分布计算置信区间，Exact Binomial Test比较月/年数据与总体均值，以及利用GLMM（含年份随机效应）和GLM分析前30天积温和最低相对湿度对月流行率的影响，冬季（11月至3月）变量用于春季数据分析。
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Results（结果）
在2017–2022年间，共检测了29,715只游离蜱（2716池若虫和2555只个体成蜱）。若虫平均EPP为0.3%，成蜱平均流行率为1.8%。若虫最高EPP为2021年的0.8%，且在2018、2019和2022年未检测到病毒；成蜱最高流行率为2017年的9.0%，2018和2019年未检测到。
在同时检测到病毒的年份（2017、2020、2021），若虫平均最高EPP出现在7月（0.8%），其次是8月（0.7%）；成蜱平均最高流行率出现在6月（8.6%），其次是5月（4.4%）。Exact Binomial Test显示若虫在2017年9月及2021年7、8、10月显著偏高；成蜱在2017年6、7月及2020年5月显著偏高，而在部分年份的3、4、8、9、10月显著偏低。
GLMM分析显示，若虫月流行率的最佳模型仅包含前一个月的积温（Estimate=0.002, P=0.011），呈正相关；成蜱月流行率的最佳模型包含前一个月的积温（Estimate=0.005, P=0.005，正相关）和最低相对湿度（Estimate=-0.164, P=0.000，负相关）。
结合本研究及Vikse等人2011–2016年春季（4月或5月）数据，若虫平均EPP为0.2%，成蜱平均流行率为2.0%。GLM分析显示，春季若虫流行率与前一冬积温无显著关系；春季成蜱流行率与前一冬积温呈显著正相关（Estimate=0.016, P=0.025），与最低相对湿度无显著关系。
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Discussion（讨论与结论）
这是挪威首个针对蓖子硬蜱的长期（六年）TBEV监测研究，包含若虫和成蜱流行率的月度评估。总体流行率与先前2011–2016年数据相似，但由于部分年份未检测到病毒，整体较低。
研究观察到了明显的季节性差异：若虫流行率倾向于在夏末或初秋较高，而成蜱在春季和初夏较高。这与德国观察到的差异一致，可能由于若虫在夏末秋初采集时多已完成幼虫取食和夏季蜕皮，而秋季活动的成蜱可能是上一年蜕皮后长期滞育的老龄蜱；此外，不合格宿主（如鹿）比例随季节变化影响共饲喂传播也可能是一个因素。
结果表明，在挪威南部，更多的积温与若虫和成蜱中TBEV流行率增加有关。但若虫仅在分析月度数据时显著，分析春季数据时冬季积温不显著，可能是因为冬春积温太低不足以使病毒复制到可检测水平。积温对成蜱流行率的有利影响甚至在仅分析春季数据时也显著，这可能是因为成蜱比若虫更耐低温和低湿，冬季在斯堪的纳维亚和中欧可有活动，雪层为地下滞育蜱保温，且Mandal冬季均温 seldom 低于0°C，足以维持成蜱体内可检测病毒载量。成蜱流行率随最低相对湿度增加而增加的现象未在春季数据中观察到，可能因Mandal相对湿度常年稳定造成温度效应偏倚。由于数据量及未测试的混杂变量（反映为GLMM中年份随机效应解释的大量方差），结果需谨慎看待。
年际变异可归因于前几年气象条件及啮齿动物种群动态波动。共饲喂是维持蜱种群中TBEV的重要机制；低湿度使若虫和幼虫在植被中搜寻高度一致增加共饲喂机会；秋冬急剧降温和春季迅速变暖可能增加若虫和幼虫同步性从而提高共饲喂传播；啮齿动物低密度时蜱聚集取食增加也提高传播几率。
病毒在若虫三年、成蜱两年未检测到，可能因低温下病毒复制率低使病毒载量低于检测限（如2018、2019未检出，2020恢复），这也解释了北部挪威有病毒但无人类病例（初始低病毒载量不足以突破免疫系统）。成蜱流行率常高于若虫且有时若虫阴性而成蜱阳性（如2022），提示成蜱在TBE人类病例流行病学中的作用，且检测成蜱有助于以更小样本发现新疫源地。
结论：挪威南部蜱传脑炎病毒流行率表现出不同生命周期阶段的季节性，若虫峰值在春末夏初，成蜱峰值在夏季至初秋。积温和相对湿度是重要的环境驱动因素，但宿主动态等因素也需考虑研究。预计未来几十年挪威南部夏季更干更长、生长季延长，可能对TBEV流行率产生不同影响，需持续监测。未来研究应聚焦气候变化和土地利用对该新兴病毒在挪威循环的影响。
