整合转录组学揭示了调控人类巨核细胞生成的的关键调控网络：来自CD34+巨核细胞成熟过程的见解

《Thrombosis Research》：Integrative transcriptomics elucidates core regulatory network governing human megakaryopoiesis: Insights from CD34+-derived megakaryocyte maturation

张子岩|王月|刘鹏

复旦大学附属中山医院血液科，上海，200032，中国

摘要

巨核细胞生成是一个复杂的生物过程，主要发生在骨髓中。为了更深入地了解驱动正常巨核细胞生成的分子机制，我们利用了一种基于外周血来源的CD34⁺细胞的体外巨核细胞培养系统。通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出CD41^high和CD41^dim巨核细胞亚群后，通过巨核细胞特异性表面标记物的鉴定、倍性分析、Giemsa染色和免疫荧光确定了成熟的巨核细胞。随后对这些不同群体的大规模RNA测序，识别出了差异表达基因（DEGs）和富集的信号通路。根据我们的CD34⁺衍生的巨核细胞分化模型，发现CD41的表达在第4天开始显著增强，并在第10天进一步升高。CD41^high亚群表现出CD42b和CD61的显著共表达，以及更高比例的多倍体细胞（≥16 N），同时具有成熟巨核细胞的特征性形态学特征，包括前血小板形成、细胞质成熟和细胞体积增大，相比之下CD41^dim亚群则没有这些特征。对这两个群体的转录组分析发现了1877个上调和1817个下调的DEGs。关键DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析揭示了包括VWF、PF4V1、SELP、PF4、GP1BA、CD40LG、PPBP、CLEC1B、P2RY12和THBS1在内的核心基因。功能富集分析强调了迁移能力、粘附能力和分泌能力的获得，这体现在血小板激活和伤口愈合相关基因的显著上调。本研究提供了人类巨核细胞成熟的整体转录组图谱，并强调了新的治疗 thrombopoiesis 的候选目标。

引言

巨核细胞生成始于造血干细胞（HSCs）向巨核细胞谱系的定向分化，随后是其前体细胞的增殖、成熟和终末分化。根据经典的造血 hierarchy 模型 [1]，HSCs 首先产生多能前体细胞（MPPs），然后逐渐分化为共同髓系前体细胞（CMPs），进一步分化为巨核细胞-红细胞前体细胞（MEPs），后者具有双能性，只能产生巨核细胞（MKs）和红细胞 [2]。随后产生单能的巨核细胞前体细胞（MkPs），它们专门负责生成巨核细胞和血小板。巨核细胞体积较大（直径50–100 μm），为多倍体细胞（平均16 N），在骨髓中含量稀少，仅占骨髓中有核细胞的0.05%–0.1% [3]。它们具有独特的边界膜系统（DMS）和特定蛋白质及细胞器的表达 [4]。一旦形成，巨核细胞会经历一个称为 thrombopoiesis 的成熟过程，最终每天向血液中产生约1–2 × 10¹¹个血小板 [5]。除了在血小板生成中的作用外，越来越多的证据表明巨核细胞对多种病理生理过程也有重要贡献。它们通过表达与炎症和免疫相关的表面标记物积极参与免疫反应，分泌细胞因子、趋化因子和其他炎症介质，并调节HSCs及其他骨髓细胞的活性 [6]、[7]、[8]。

尽管越来越多的研究已经阐明了巨核细胞生成的机制 [9]、[10]，但许多血小板减少症的发病机制，如免疫性血小板减少症（ITP）和造血干细胞移植后的长期孤立性血小板减少症（PT），仍然不完全清楚，这体现在相当比例的患者对现有疗法反应不佳。因此，迫切需要进一步研究以增强巨核细胞生成和血小板生成的能力。几个转录因子在基因表达调控层面参与了巨核细胞生成。对来自卵黄囊、胎儿肝脏和人类胚胎干细胞（hESCs）的巨核细胞进行的单细胞转录组分析揭示了巨核细胞的细胞异质性，描绘了早期发育轨迹，并确定thrombospondin 1（THBS1）是巨核细胞偏向性内皮细胞的标志物 [11]。SCL/TAL1和RUNX1是参与小鼠定向造血的关键转录因子，调控红细胞和巨核细胞的定向分化 [12]、[13]、[14]、[15]。GATA1、FOG1（也称为ZFPM1）和FLI-1共同调控负责巨核细胞增殖和成熟的遗传程序 [16]。同时，NF-E2协调了巨核细胞成熟过程中细胞骨架重组、甘油脂代谢和神经活性配体-受体相互作用的基因表达 [17]、[18]。此外，CD148和CD48这两种表面标记物被确定为具有免疫相关特征的成熟巨核细胞的标识符。功能上，这些CD148⁺CD48⁺巨核细胞对免疫刺激反应迅速，表达高水平的免疫受体和介质，可能代表了巨核细胞谱系中的专门免疫监视细胞 [7]。

几十年来，多个研究小组已经使用来自外周血、脐带血、胎儿肝脏和骨髓的CD34⁺ HSCs在体外成功生成了巨核细胞和血小板。通过对CD34⁺衍生的巨核细胞的研究，研究人员显著提高了我们对巨核细胞分化和血小板减少症病理生理学的理解。例如，Kollotzek等人应用CRISPR/Cas9在源自人类CD34⁺前体细胞的巨核细胞中删除CSNK1A1基因，阐明了酪蛋白激酶1α（CK1α）作为巨核细胞细胞骨架动态、极化和血小板生成的关键信号分子的作用 [19]。Chen等人发现胰岛素样生长因子1（IGF-1）能够促进CD34⁺细胞向巨核细胞的分化，并增强培养的巨核细胞的前血小板形成和血小板生成 [20]。在此基础上，结合我们之前的实验经验，我们使用来自外周血干细胞的CD34⁺细胞，发现甲基化抑制剂可以通过靶向DNMT3A介导的甲基化来改善巨核细胞的增殖和分化 [9]。此外，我们的工作还发现了5-羟色胺受体7（5-HTR7）[10]和肿瘤坏死因子（TNFα）[21]在巨核细胞生成和血小板生成中的不同功能作用，为血小板减少症的治疗提供了新的潜在途径。

在本研究中，从健康供体的外周血中分离出CD34⁺ HSCs，并在体外将其分化为巨核细胞。所得细胞用CD41（整合素αIIb，也称为ITGA2b或GPIIb）进行染色，这是巨核细胞谱系的经典标记物。根据CD41的表达水平，我们分离出了两个不同的群体：CD41^high和CD41^dim细胞。流式细胞术倍性分析和形态学评估确认CD41^high群体具有成熟巨核细胞的特征，包括高倍性和独特的形态。随后对这些群体进行的大规模RNA测序发现了许多先前报道的巨核细胞成熟相关标记物，从而证实了我们体外模型的可靠性和代表性。总体而言，我们的发现为巨核细胞的正常生成提供了修订后的路线图，提供了对细胞分化机制的新见解，并确定了该过程中多个新的关键基因。需要进一步的研究来验证和探索这些发现，以阐明巨核细胞生成的潜在机制。

章节摘录

来自CD34⁺细胞的巨核细胞体外培养

CD34⁺巨核细胞培养系统按照我们发表的方法 [9]、[22] 进行。本研究中使用的外周血样本来自接受G-CSF（粒细胞集落刺激因子）诱导动员的健康供体，这是异源性造血干细胞移植的标准临床方案的一部分。从健康供体中获得的动员外周血轻轻覆盖在密度梯度培养基（Lymphoprep?）上，

从动员的外周血来源的CD34⁺细胞分化巨核细胞

从健康供体中获取了动员的外周血干细胞，通过免疫磁珠分选分离出CD34⁺造血干细胞（HSCs），然后诱导其进入体外巨核细胞分化模型，如图1A所示。经过10天的培养后，流式细胞术分析显示CD41标记物阳性的细胞显著增加。如代表性等高线图（图1B）所示，CD41阳性（CD41⁺）细胞可以清晰地

讨论

迄今为止，血小板减少症仍然是一个亟需解决的临床问题，因此需要对巨核细胞生成机制有新的认识。巨核细胞的分化涉及深刻的分子变化，这些变化直接影响其功能。高通量测序技术的进步现在能够从多种样本中提取大量的基因组数据，为巨核细胞生成的机制提供了前所未有的见解，并揭示了新的治疗靶点

CRediT作者贡献声明

张子岩：写作——审稿与编辑，原始草稿撰写，研究设计，资金获取，正式分析。王月：写作——审稿与编辑，数据可视化，软件应用，方法学，数据管理。刘鹏：验证，监督，资源协调，项目管理，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了复旦大学附属中山医院（ZSZP202549）和昆山医疗健康创新项目（编号：KETDCX202410）的资助。