《Theriogenology》：OVULATORY RELEASE AND OVIDUCTAL RECOVERY AFTER INTRAFOLLICULAR TRANSFER OF IMMATURE OOCYTES (IFIOT) IN CATTLE
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José de Oliveira Carvalho|Felipe Lopes Ruas|Livia Martino-Duarte|Tiago Velozo Pereira Jorge|Michele Ricieri Bastos|André Bianchini Covre|Tha
José de Oliveira Carvalho|Felipe Lopes Ruas|Livia Martino-Duarte|Tiago Velozo Pereira Jorge|Michele Ricieri Bastos|André Bianchini Covre|Thais Gon?alves Tavares|Jankerle Neves Boeloni|Guilherme Pugliesi|Margot Alves Nunes Dode|José Felipe Warmling Spricigo
巴西圣埃斯皮里图联邦大学，动物繁殖实验室，阿莱格雷，圣埃斯皮里图州
摘要
卵泡内移植未成熟卵子（IFIOT）是一种新兴的生殖生物技术，它能够在体内实现卵子成熟、受精和早期胚胎发育。尽管该技术具有可行性，但其效率仍然较低，且卵子丢失的具体阶段尚未明确。本研究旨在通过直接从输卵管中回收结构来评估IFIOT后的早期卵泡期事件，特别关注不同卵子数量下的排卵释放和早期回收动态。从未经处理的卵巢中回收未成熟的卵丘-卵子复合体（COCs），并将其移植到处于同步状态且未哺乳的Nellore牛的卵泡内。接受移植的牛具有一个预排卵期的卵泡（≥10毫米），随机分为三组：仅接受培养基的对照组（CG；n = 16），接受5个COCs的组（G5；n = 15），以及接受50个COCs的组（G50；n = 16）。在撤除孕酮装置后54.5 ± 2.7小时进行IFIOT，随后立即给予GnRH以诱导排卵并进行人工授精。通过超声检查确认排卵，并在IFIOT后64–66小时（2.5天）对牛进行屠宰。解剖同侧输卵管并冲洗以回收结构，然后通过宏观和组织学方法检查发育中的黄体以检测残留的COCs。总体而言，从输卵管中回收了30.8%的注射卵子，G5组和G50组之间的回收率没有差异。值得注意的是，在排卵后2.5天，在发育中的黄体腔内发现了COCs（G50组：n = 16；G5组：n = 2），这表明部分注射卵子在排卵过程中未能释放。这些发现揭示了排卵释放不完全是IFIOT中卵子丢失的一个先前被忽视的原因。这些结果为IFIOT后的早期事件提供了新的见解，并强调了排卵释放是提高该技术在牛繁殖中效率的重要因素。
引言
卵泡内移植未成熟卵子（IFIOT）是一种新兴的生殖生物技术，它旨在结合体内和体外胚胎生产系统的优势，使卵子成熟、受精和早期胚胎发育直接在雌性生殖道的生理环境中进行。虽然IFIOT的技术可行性已经得到验证，也有报道了存活的胚胎、妊娠和活产案例[1]，但结构回收率和胚胎产率仍然较低。研究显示回收率在22.0%[2]到47.6%[1]之间，胚胎产率在4.7%[2]到18%[3]之间。这些数值远低于体外胚胎生产（IVP）的成果，在IVP中大约40%的卵子能够发育到囊胚阶段[4]，这限制了IFIOT的商业应用，并突显了需要查明其效率低下的原因。
作为一种相对较新且仍在发展的生物技术，IFIOT效率低下的原因尚未完全明了。一个主要假设是过程中的早期步骤，如排卵时卵丘-卵子复合体（COCs）的释放以及伞状突起捕获大量COCs，是导致卵子丢失的关键点。在牛的情况下，输卵管生理上适应于每个发情周期捕获和运输一个卵子。然而，在IFIOT中，一个卵泡在排卵时会同时释放大量COCs。这种人工条件可能会干扰卵泡的完全排空，影响伞部对COCs的捕获，或者超出输卵管捕获多个COCs的能力。
另一个可能的限制因素是过多结构对输卵管微环境的影响。已知精子[5]、卵子[7]、[8]和胚胎[9]、[10]的存在会改变输卵管及其管腔液的特性，影响蛋白质分泌、代谢底物的可用性以及纤毛和肌肉的活动。因此，异常大量的COCs可能会破坏输卵管的稳态，从而可能改变输卵管的功能平衡，进而影响受精、早期胚胎发育以及胚胎向子宫的运输。尽管之前的研究使用了不同数量的注射卵子（10到60个COCs[1]、[2]、[3]、[11]），但所有研究都是通过子宫冲洗来评估IFIOT的效率。因此，这些研究未能明确卵子丢失是发生在排卵释放阶段、伞部捕获阶段，还是输卵管运输过程中。此外，没有研究同时比较了显著较低与较高COC数量对这些早期、依赖输卵管的阶段的影响。
鉴于此，本研究旨在评估IFIOT中注射的COCs数量是否影响排卵释放和输卵管捕获的效率，这可以通过排卵后早期从输卵管中回收的结构来推断。为此，在排卵后早期直接从输卵管中回收结构，从而确定有效释放和捕获的COCs比例与总注射数量之间的关系。这种方法有助于了解文献中报告的低回收率是否源于这些早期阶段的失败，从而有助于识别限制IFIOT效率的因素，并为该技术在牛繁殖中的改进和未来应用提供帮助。
章节片段
材料与方法
所有程序均获得了圣埃斯皮里图联邦大学动物研究伦理委员会的批准（协议编号026/2020）。
回收结构的牛的比例
在47头接受IFIOT的牛中，45头（95.7%）确认发生了排卵，而CG组中的1头和G50组中的1头未排卵，因此被排除在分析之外。在动物层面，大多数牛（35/45；77.8%）在输卵管冲洗后至少回收到一个结构。CG组中有73.3%的牛至少回收到一个结构，而G5组和G50组分别为66.6%和86.6%。假设每头受体的一个胚胎来源于...
讨论
尽管IFIOT是一种有前景的体内胚胎生产方法，但其技术效率仍然较低且在受体之间差异很大，文献中一致报告了较低的回收率和胚胎产率[1]、[2]、[3]、[11]、[13]。大多数先前的研究仅在排卵后七天通过子宫冲洗来评估IFIOT的效率，这一终点仅反映了过程的最终结果，无法识别...
结论
总之，本研究的结果表明IFIOT可以在体内产生裂解的结构，证实了在所评估的实验条件下该技术的可行性。观察到排卵后2.5天在发育中的黄体内仍有COCs存在，提供了新的证据，表明排卵释放不完全可能是IFIOT中卵子丢失的原因之一，这一步骤在之前的研究中被忽视了。尽管在输卵管中未检测到差异...
CRediT作者贡献声明
Margot Alves Nunes Dode：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据管理，概念化。Guilherme Pugliesi：方法学，研究，资金获取，数据管理。José Felipe Warmling Spricigo：撰写 – 原稿，方法学，正式分析，概念化。André Bianchini Covre：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。Michele Ricieri Bastos：方法学，研究，数据管理，概念化。Jankerle Neves Boeloni：
资助
本工作得到了FAPES（圣埃斯皮里图州研究与创新基金会）、CNPq（国家科学技术发展委员会）和CAPES（高等教育人员培训协调委员会）通过研究资助和奖学金的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
