《Theriogenology》：Intravaginal GnRH analogues in rabbits: Fertirelin as the most effective option for ovulation induction
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Juan José Castillo | José Salvador Vicente | Francisco Marco-Jiménez | María Pilar Viudes-de-Castro
动物研究与技术中心（CITA），瓦伦西亚农业研究所（IVIA），卡斯特尔隆，西班
Juan José Castillo | José Salvador Vicente | Francisco Marco-Jiménez | María Pilar Viudes-de-Castro
动物研究与技术中心（CITA），瓦伦西亚农业研究所（IVIA），卡斯特尔隆，西班牙
摘要
兔子是反射性排卵动物，需要外源性激素刺激（通常是促性腺激素释放激素（GnRH）类似物）来诱导人工授精（AI）过程中的排卵。虽然肌肉注射是标准方法，但通过精液补充剂进行阴道给药可以减少对动物的处理，从而提高其福利。然而，由于蛋白质快速降解，这种方法通常需要更高的剂量。本研究评估了三种GnRH类似物（fertirelin、buserelin和deslorelin）在新西兰白兔中的效果，包括排卵诱导、繁殖性能以及最低有效浓度。共进行了三项实验，包括通过腹腔镜直接观察排卵情况，以及评估哺乳期和非哺乳期母兔的产仔率和繁殖能力。精液扩展剂中添加了20 mM EDTA以增强激素稳定性。不同GnRH类似物对排卵频率和产仔率有显著影响（p < 0.05）。fertirelin表现出最高的效力，即使在1 μg的较低剂量下也能达到与肌肉注射相当的效果。deslorelin的效力介于两者之间，而buserelin的效力最低。非哺乳期母兔的产仔率高于哺乳期母兔（P < 0.05），但未发现类似物类型与生理状态之间的显著交互作用，表明fertirelin在各种繁殖条件下的效力一致。尽管没有显著差异（p = 0.086），但生物学趋势表明，在哺乳等生理压力下，fertirelin的相对优势可能更加明显。无论是哪种类似物还是生理状态，都不会影响总产仔数或活产仔数。fertirelin在不同生理条件下的稳定表现支持了其优越的受体亲和力，使其成为基于福利的人工授精方案的有希望的选择。
引言
兔子（Oryctolagus cuniculus）是反射性排卵动物，这意味着排卵是由交配引发的。这一繁殖特性给兔场的繁殖管理带来了挑战，因为人工授精时需要外部激素干预来诱导排卵。因此，优化排卵控制和繁殖效率对于维持商业兔生产的高产量至关重要。
在自然条件下，交配过程中遇到的各种体感刺激（包括触觉、交配、视觉和嗅觉信号[1,2]）会激活神经通路，促使促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌。随后大约1小时后，垂体前叶会分泌更多的黄体生成激素（LH），并在11-12小时内发生排卵[1,3,4]。
为了确保有效的排卵诱导，通常在人工授精过程中外源性给予GnRH类似物[5][6][7]。目前农场常用的方法是授精时肌肉注射GnRH类似物。几种GnRH类似物（包括gonadorelin、triptorelin、leuprolerin、lecirelin和buserelin）已被证明能引发与自然交配相当的排卵反应[4,8,9]。
尽管这些方法有效，但肌肉注射存在一些缺点，如增加动物处理次数、提高应激水平以及引发动物福利方面的担忧[4][5][6][9][10]。此外，每种GnRH类似物的理化性质和分子结构对其生物利用度和生物活性有重要影响[11]。通过针对性的结构修饰（如替换或删除天然十肽结构中的特定氨基酸），可以增强其活性。在6位点进行替换并添加C端乙酰胺基团的类似物表现出更强的抗蛋白降解能力和更高的效力[12]。然而，这些类似物在体内的效力高度依赖于物种，并且因实验模型而异，导致研究结果存在显著差异[11]。例如，triptorelin在大鼠中的效力大约是buserlin的六倍[11]，但在兔子中的比较研究却得出相反的结果，buserelin产生了更强的排卵反应[10]。
因此，最近的研究越来越多地关注GnRH在兔子体内的非侵入性给药途径。阴道给药作为一种有前景的替代方法，因为激素可以直接加入精液扩展剂中，从而减少处理带来的应激和劳动强度。然而，这种方法的效力受到雌性生殖道内酶（存在于精液血浆、阴道黏膜中，可能还有扩展剂成分）引起的蛋白降解的限制[5][9][11]。因此，通常需要通过阴道途径给予显著更高的激素剂量才能达到与肌肉注射相当的效果。为克服这一限制，提出了多种策略，例如添加蛋白酶抑制剂，尤其是乙二胺四乙酸（EDTA）和bestatin。正如我们团队之前报道的[13]，这些分子对精液血浆中的氨基肽酶的抑制作用大大提高了GnRH在扩展剂中的稳定性和生物利用度，而不影响繁殖性能。使用壳聚糖纳米颗粒封装GnRH类似物是一种有前景的方法，它可以提高激素保护作用并减少所需剂量[14][15][16]。
尽管GnRH类似物的阴道给药在兔子繁殖管理中具有明显优势，但降低授精扩展剂中的激素浓度仍然是一个关键挑战。实现这一目标需要详细评估不同GnRH类似物的相对效力。虽然之前的研究已经证实了这种方法的可行性，但大多数研究都是在较高剂量下评估单一化合物，以克服黏膜吸收和酶降解的限制。迄今为止，还没有直接比较分析在同一实验框架内同时给予多种GnRH类似物的效果。这种知识空白阻碍了识别能够在较低浓度下引发可靠排卵反应的最有效类似物的过程。缺乏此类证据限制了人工授精方案的优化，使其难以在实际应用中得到推广。因此，本研究旨在比较三种不同GnRH类似物（fertirelin、buserelin和deslorelin）的相对效力，并确定诱导有效排卵所需的最低有效剂量，同时改善动物福利和繁殖性能。
章节片段
化学物质
测试的GnRH类似物的结构修饰见表1。buserelin由Sanofi-Aventis S.A.（巴塞罗那，西班牙）提供，deslorelin和fertirelin由NZYTech, Lda - Genes & Enzymes（葡萄牙）购买。本研究中使用的所有其他化学物质均来自Merck Sigma-Aldrich Química S.L. U.（马德里，西班牙）。
动物
使用了性成熟的雄性和雌性新西兰白兔。仅选用了多胎次的母兔（生育次数超过两次）。
结果
实验1的结果见表5。结果表明，GnRH类似物的类型对排卵频率有显著影响（p < 0.05）。对照组和接受fertirelin处理的母兔的排卵频率显著高于接受buserelin和deslorelin处理的母兔，而后两者之间没有显著差异（表5）。相比之下，排卵率（每只排卵母兔的排卵卵子数量）没有显著差异。
讨论
兔子的人工授精需要给予GnRH类似物来触发排卵过程。传统上，这需要肌肉注射，这种方法由于增加了动物处理应激而引发福利问题[5,10]。阴道给药是一种较少的应激方法，代表了人工授精技术的改进。然而，主要挑战在于防止激素的快速降解。
结论
本研究表明，GnRH类似物在兔子体内的阴道给药效果取决于化合物的具体分子结构以及给药系统提供的稳定性。在测试的三种类似物中，fertirelin表现出最可靠和一致的性能，即使在较低剂量下也能达到与肌肉注射相当的效果。其相对于D位点替换类似物的优越活性表明，天然的Gly6残基起着关键作用。
CRediT作者贡献声明
Juan José Castillo：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、数据分析、数据管理。José Salvador Vicente：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、资金获取、数据分析、概念化。Francisco Marco-Jiménez：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、资金获取、概念化。María Pilar Viudes-de-Castro：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资源协调、项目管理。
利益冲突声明
作者声明与本手稿所述研究无任何利益冲突。所有作者均无可能不恰当地影响或偏倚研究内容的财务或个人关系。
致谢
本研究是R&D&I项目PID2021 127867OB I00的一部分，该项目由MCINAEI/10.13039/501100011033/和ERDF “Una manera de hacer Europa”资助。此外，还得到了PRE2022（由MCINAEI/10.13039/501100011033 ESF+ “Invierte en tu futuro”资助）的支持。
