小红鹿（Mazama jucunda）诱导多能干细胞制备及未来应用的研究进展

《Theriogenology Wild》：Insights for Producing and Future Use of Induced Pluripotent Stem Cells from the Small Red Brocket Deer (Mazama jucunda)

　　

研究人员针对大西洋森林特有濒危鹿种——小红鹿（Mazama jucunda），开展了一项概念验证性研究，旨在开发源自成年个体的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）制备与表征方案。研究中，研究人员从皮肤活检组织中分离成纤维细胞，并对其形态与倍增时间进行表征。实验分为两次转导：首次转导增强型绿色荧光蛋白（enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP）报告基因，用于验证慢病毒递送系统的效率；第二次转导小鼠来源的OSKM多能性因子（OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC），以实现体细胞重编程。结果显示，研究人员成功建立了GFP阳性细胞系，证实该慢病毒系统在目标细胞中具有高效转导能力，并获得可用于后续OSKM转导的小红鹿GFP阳性细胞系。在OSKM转导实验中，首次转导后第33天观察到具有典型集落形态的细胞聚集，但这些集落在后续培养中未能维持经典的多能性特征。研究人员指出，从体细胞获得iPSCs是一项极具前景的生物技术，目前仅有一例鹿科动物iPSC诱导成功的报道，本研究为深入理解不同鹿种的细胞重编程通路提供了重要数据，有助于未来将其应用于物种保护计划。

小红鹿（Mazama jucunda）是分布于巴西大西洋森林的小型鹿类，被世界自然保护联盟（IUCN）列为易危物种，野生种群数量稀少且分布狭窄，加之迁地繁殖项目缺乏足够个体和有效遗传管理手段，使其面临较高的灭绝风险。辅助生殖技术（Assisted Reproductive Techniques, ARTs）与生物样本库建设已成为野生动物保护的重要策略，但针对非模式野生动物的技术体系仍不完善，尤其是鹿科动物中仅有少量诱导多能干细胞（iPSCs）研究。iPSCs可通过重编程体细胞获得类似胚胎干细胞的多能状态，为体外配子发生、遗传资源保存和濒危物种繁育提供新的可能。研究人员在此背景下，尝试将已优化用于家牛的慢病毒转导方案应用于小红鹿成纤维细胞，探索其在鹿科动物中的适用性，并评估重编程的可行性。

本研究的主要关键技术方法包括：利用来自单一个体冷冻保存的皮肤活检样本，分别采用机械法和化学法分离成纤维细胞并进行扩增与形态学鉴定；构建携带eGFP报告基因及小鼠OSKM多能性因子的慢病毒载体，对细胞进行转导并观察转导效率；在OSKM转导后将细胞培养于小鼠胚胎成纤维饲养层上，使用含碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的专用培养基进行长期培养，监测集落形成情况。

研究结果如下：

3.1 体细胞分离与表征

研究人员发现机械法与化学法均能有效从冷冻皮肤样本中分离出成纤维细胞，细胞呈典型梭形贴壁生长，倍增时间平均为44.20±3.79小时，初期生长速度较慢，随后进入稳定增殖阶段。

3.2 GFP阳性细胞系的建立

慢病毒介导的eGFP报告基因成功转入细胞，并在荧光显微镜下检测到稳定的绿色荧光信号，验证了该递送系统在小红鹿细胞中的有效性。

3.3 多能性诱导

OSKM转导后第33天，在多个重复实验中观察到具有圆形、边界清晰的疑似iPSC集落，但在手动分离转移至新饲养层后，这些集落未能持续增殖并逐渐退化。

在讨论部分，研究人员指出这是首次在小红鹿中开展基因递送与重编程尝试，虽然未能获得稳定iPSC系，但初步集落的形成表明慢病毒系统可用于该物种的基因导入。与沼泽鹿（Blastocerus dichotomus）的重编程结果相似，单独使用小鼠OSKM因子可能不足以在鹿科动物中实现完全重编程，未来可尝试加入NANOG、LIN28、RARG、LRH1等辅助因子，并使用亲缘关系更近的物种来源基因。此外，培养基成分优化、非整合型基因递送方法（如仙台病毒、合成mRNA）应成为后续研究的重点，以降低基因组插入突变风险，保障保护应用的安全性。

结论部分翻译：

据研究人员所知，本研究首次报道了针对濒危鹿种小红鹿的基因递送实验，成功建立了该物种的首个GFP阳性细胞系，并获得了首批形态上符合iPSC特征的集落。尽管尚未获得稳定iPSC系，但该工作展示了慢病毒系统在目标细胞中的高效转导能力，并为进一步优化重编程条件奠定了基础。由于样本量有限，未来需在更多个体中验证该方案在种群层面的适用性。本研究为小红鹿及其他濒危鹿类的细胞重编程技术发展提供了重要参考。