RASGRP3通过RAP1依赖的信号途径，在山羊（Capra hircus）中调控胎盘叶原基的滋养层形态发生

《Theriogenology》：RASGRP3 orchestrates trophoblast morphogenesis of placental cotyledons via RAP1-dependent signaling in goat (Capra hircus)

　　

赵俊银|罗南坚|郑吉康|肖敏|方行强|赵永菊

西南大学动物科学与技术学院，重庆食草动物科学重点实验室，中国重庆400715

摘要

胎盘叶的发育对反刍动物的胎儿生长至关重要，滋养层在胎盘形成和营养交换中起着关键作用，这是通过严格调控的分子机制实现的。RAS鸟苷释放蛋白3（RASGRP3）是一种鸟苷核苷酸交换因子，已知可以调节细胞增殖和迁移；然而，其在反刍动物胎盘发育中的具体作用仍不清楚。在本研究中，我们利用体外和体内综合方法探究了RASGRP3在山羊胎盘形成中的作用。发现RASGRP3在妊娠中期（第45-90天）时在滋养层细胞中表达达到峰值，并与胎盘叶的大小呈正相关。功能实验表明，RASGRP3的敲低会抑制滋养层的增殖、迁移和侵袭能力，同时促进细胞凋亡和线粒体功能障碍。从机制上讲，RASGRP3通过RAP1GTP激活PI3K/AKT/mTOR信号通路；而通过药物激活RAP1或PI3K/AKT可以部分恢复因RASGRP3缺失而受损的细胞功能。在体内实验中，腺病毒介导的RASGRP3基因沉默导致胎盘叶大小减小和滋养层GTP酶活性降低，而过表达则产生相反的效果。这些发现表明RASGRP3通过RAP1介导的PI3K/AKT/mTOR通路成为调控山羊滋养层功能和胎盘发育的关键因子，这是首次实验性证据，揭示了RASGRP3在反刍动物胎盘发育中的作用及其分子机制，为滋养层调控和胎盘形态发生的分子基础提供了新见解。

引言

提高山羊的繁殖效率对于增强全球山羊产业的可持续性和经济可行性至关重要。胎盘是连接母体和发育中胎儿的唯一器官，对妊娠过程至关重要[[1], [2], [3]]。它充当胎儿的临时肝脏、肾脏、肺、内分泌器官和消化系统，促进血液生成、物质交换、代谢调节、内分泌控制，以及提供屏障和免疫保护，以确保妊娠成功[[4], [5], [6], [7]]。山羊的胎盘含有密集的绒毛，这些绒毛是母体与胎儿之间进行营养交换的主要场所，与子宫腺体和乳晕共同在整个妊娠期间提供必要的组织支持[8,9]。妊娠早期，胎盘经历快速的血管生成和绒毛发育，以满足胎儿不断增长的营养和氧气需求[10,11]。胎盘叶的发育，包括绒毛形态、密度和面积的变化，显著影响反刍动物的繁殖性能，特别是出生率和出生体重[12,13]。妊娠早期对胎盘发育至关重要，因为胎盘叶的形成直接影响母体与胎儿之间的物质交换效率和胚胎发育。此外，妊娠早期正常的胎盘叶发育对于胎儿的正常生长和犊羊的质量及存活率也非常重要；然而，其背后的调控机制尚不明确。

在山羊中，胎盘叶的形成依赖于滋养层与子宫内膜蜕膜的独特相互作用，这决定了胎盘的功能区域，对于有效的母体-胎儿物质交换和妊娠维持至关重要[14,15]。这一过程涉及滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭[16,17]。我们此前报告称，在妊娠早期的山羊胎盘滋养层膜中观察到显著的生长、粘附和血管生成[18]。通过转录组分析和胎盘绒毛滋养层基因筛选，发现RAS鸟苷释放蛋白3（RASGRP3）可能是胎盘发育的潜在调控因子。然而，RASGRP3调控胎盘叶发育的具体机制仍不清楚，需要进一步深入研究RASGRP3介导的信号通路及其在胎盘叶发育过程中的滋养层功能。

RASGRP3属于RASGRP家族，作为一种GTP/GDP交换因子，可促进小GTP酶（RAS和RAP）从非活性状态转化为活性状态，从而参与多种细胞活动[19,20]。它通过激活H-RAS、R-RAS和RAP1来调节细胞能量代谢，在B细胞和T细胞功能中起关键作用，尤其是在B细胞增殖和抗原反应方面。此外，RASGRP3通过促进RAP1向RAP1GTP的转化，显著影响多种细胞功能的调节和疾病预后[21,22]。RASGRP3通过激活由Toll样受体触发的巨噬细胞炎症反应途径中的RAP1小GTP酶反应，减少mRNA的表达[23]。值得注意的是，磷酸脂质3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素激酶靶标（PI3K/AKT/mTOR）通路对细胞增殖和存活至关重要[24,25]。PI3K/AKT通路抑制剂可抑制滋养层细胞的迁移和侵袭[[26], [27], [28]]。我们之前的转录组分析显示PI3K/AKT/mTOR通路显著富集，表明其在胎盘发育中的重要性。激活后，RAP1增强整合素活性、细胞粘附性和细胞-ECM相互作用，这些对于细胞粘附、侵袭、迁移和血管生成至关重要。在胎盘组织中，RAP1调节滋养层细胞的融合和侵袭，活性RAP1在细胞连接形成和延伸中起关键作用。RASGRP3通过激活RAS和RAP1来调节下游信号网络，如PI3K/AKT通路，从而影响多种细胞功能。尽管一些研究探讨了RASGRP3与PI3K/AKT/mTOR通路在免疫[29]、癌细胞[30]和血管生成[31]中的相互作用，但胎盘叶发育的具体机制，尤其是滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭机制仍不明确。此外，RASGRP3对RAP1、RAS及其在胎盘发育过程中对PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用尚不清楚。

在本研究中，我们系统地研究了RASGRP3在胎盘叶发育中的作用及其分子机制，重点关注其对RAP1和PI3K/AKT信号通路的调控效应。通过结合细胞功能测试和山羊动物实验，全面评估了RASGRP3对妊娠早期胎盘发育和胎盘叶形成的影响。我们的发现为反刍动物胎盘发育的调控机制提供了新的见解，为提高产羔率、优化胎盘功能和增加新生羔羊出生体重提供了理论基础，最终提升畜牧业的繁殖效率。

部分摘录

组织样本收集

所有实验程序均得到了西南大学动物伦理委员会的批准（批准编号IACUC-20240506-06）。胎盘组织取样自国家遗传资源品种大足黑山羊，在妊娠第20、25、30、45、60、90、120和150天进行（每个阶段5只）。所有山羊均在西南大学黑山羊研究所的实验场饲养，遵循大足黑山羊替换母羊（DB50/T 510-2013）的标准管理方案。

山羊胎盘叶中RASGRP3的表达和定位

Western blot分析显示，妊娠期间山羊胎盘组织中RASGRP3蛋白的表达具有组织特异性和妊娠依赖性。具体而言，RASGRP3在蜕膜和子宫内膜中的表达水平较低，而在滋养层和胎盘叶中的表达显著增加。在胎盘叶中，RASGRP3的含量在妊娠第45天后急剧上升，第60天左右达到峰值，此后保持较高水平。在滋养层中，RASGRP3的表达也有所增加

讨论

胎盘体和胎盘叶的生长对于反刍动物妊娠期间胎盘的发育和功能至关重要[32,33]。然而，参与山羊胎盘发育的具体基因和调控通路尚不清楚。我们的初步研究发现，山羊胎盘滋养层组织中鸟苷核苷酸交换因子（GEF）相关基因（包括RASGRP3）的表达水平显著上调。为了系统研究这些基因，我们进行了

结论

RASGRP3被确定为山羊胎盘叶发育的核心调控因子，通过RAP1驱动的PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥作用。其表达在滋养层中富集，并随妊娠阶段增加，这与胎盘叶的形态发生相吻合。RASGRP3的缺失会损害RAP1的激活和下游信号通路，导致滋养层增殖、迁移和侵袭能力下降，而通路的重新激活可部分恢复这些缺陷。体内实验证实了RASGRP3的关键作用

CRediT作者贡献声明

赵俊银：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，软件应用，方法学，实验设计，数据分析。罗南坚：数据验证，方法学，实验设计，数据管理，概念构思。郑吉康：数据验证。肖敏：可视化。方行强：方法学。赵永菊：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源获取，资金筹集。

数据和可用性声明

本研究生成或分析的数据集可应要求向相应作者索取。

资助声明

本研究得到了以下机构的财政支持：国家重点研发计划（项目编号2022YFD1300202）、国家自然科学基金（项目编号NSFC31772564）、重庆市科研机构和企业种质资源收集、利用与创新项目（cqnyncw-kqlhtxm）、现代农业生产技术体系（项目编号CQMAITS202513）以及教育部门的高等教育机构自然科学科研项目

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的利益冲突或个人关系。

致谢

作者衷心感谢西南大学黑山羊研究所的实验农场提供的实验条件和样本收集方面的协助。